《眼科新进展》  2024年7期 526-530   出版日期:2024-07-01   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
树枝状大分子N-乙酰半胱氨酸纳米聚合物对视网膜血管重建的作用


视网膜血管重建是缺血缺氧后视网膜无血管区和病理性新生血管(NV)修复的过程。其中,血管内皮细胞通过出芽、增殖、迁移并连接成管。氧化应激在血管重建中起关键作用。活性氧(ROS)对血管生成的作用取决于组织背景、程度和氧化应激等因素。低水平ROS可促进视网膜血管生成,但高水平ROS则导致过度氧化应激进而抑制血管重建[1]。然而氧化应激也可引起炎症因子释放正反馈促进ROS产生,如肿瘤坏死因子α和细胞间黏附分子-1抑制缺血性视网膜病变(IRs)血管重建[2-3]。研究证实,过量ROS与血管舒张有关[4]。有研究表明,ROS在糖尿病视网膜病变和早产儿视网膜病变中过量表达[5-6]。ROS与氧诱导的视网膜病变(OIR)超氧化诱导直接相关[7]。外源性抗氧化剂可显著促进缺血视网膜的血管重建,如超氧化物歧化酶或抗氧化药物可减少OIR中视网膜血管闭塞区(VO)[8-9]。因此,研究ROS在OIR血管重建中的作用及机制显得尤为重要。
N-乙酰半胱氨酸(NAC)是一种抗氧化剂和抗炎剂,也是谷胱甘肽(GSH)形成的前体,GSH可直接清除ROS。但是其药物生物利用度低,需要高剂量重复给药,且具有血液自发氧化、血液稳定性差和细胞毒性等缺点[10],因此无法在临床直接应用。研究发现,纳米技术可提高药物生物利用度和靶向性,是良好的药物和基因载体,树枝状大分子(Dendrimer)是树状纳米结构粒子,具有细胞高水平摄取、非细胞毒性、非免疫原性和可完全清除等优点,而PAMAM-G4-OH是新一代Dendrimer[11]。本研究采用了PAMAM-G4-OH Dendrimer与NAC的共聚物Dendrimer-NAC(D-NAC)进行实验。Dendrimer 对GSH响应,它通过连接20个NAC分子高效荷载药物,靶向作用于视网膜中激活的神经胶质细胞。本研究通过对OIR小鼠玻璃体内注射D-NAC清除ROS,观察其对视网膜血管重建的影响。
Delta样4配体(DLL4)是I型膜蛋白Notch配体家族,也是血管内皮细胞唯一表达的Notch配体,在生理性NV中低表达。Notch信号转导在NV出芽生成的尖端/茎细胞中起枢纽作用,其中Notch1最为相关。DLL4以细胞接触依赖方式结合Notch家族受体,导致Notch胞内结构域(NICD)分裂[12]。从Notch切下NICD进入细胞核,与转录因子视黄醇结合蛋白J结合,调节转录抑制因子Hes、Hey家族及NRARP表达[13]。本实验拟探讨纳米试剂D-NAC对OIR血管重建的作用及分子机制。
1 材料与方法 
1.1 实验动物及分组
健康级7 d 龄C57BL/6J小鼠104只由西安交通大学医学部动物中心提供,雌雄不限,体重5~7 g,同母鼠共同养育。饲养环境:室温为22~25 ℃,湿度为50%~70%,12 h光照昼夜循环,小鼠自由摄水和摄食。实验分为正常对照组、OIR+Dendrimer组和OIR+D-NAC组3组,3组小鼠均行视网膜GSH检测,后两组进行了视网膜荧光染色、qRT-PCR和ELISA检测。本研究经西安交通大学医学部生物医学伦理委员会审批(批号:XJTUAE20213-640)。
1.2 主要试剂和仪器
D-NAC聚合物由约翰霍普金斯大学纳米实验室赠送。红色荧光Alexa FluorTM 594 同工凝集素 GS-IB 4 偶联物(加拿大Life Technologies公司),体积分数10%山羊血清(美国Millipore公司),NAC、Dendrimer(美国Sigma公司),GSH试剂盒(美国Biovision公司),鼠血管内皮生长因子(VEGF)ELISA试剂盒(美国R&D Systems公司),逆转录试剂盒(德国Qiagen公司),实时荧光定量PCR(qRT-PCR)试剂盒(日本Takara公司)。实时荧光定量PCR仪(美国Agilent Technologies公司)。
1.3 OIR小鼠模型构建
小鼠出生当天记为0 d龄(P0),参照Connor等[14]的方法建立小鼠OIR模型,具体为:P0小鼠在正常氧环境下饲养至P7时小鼠及哺乳母鼠放至密闭的动物实验舱内,舱内O2体积分数稳定在75%,温度为(23±2)℃,湿度为(55±2)%。在氧舱中饲养时为避免母鼠死亡,需要每隔24 h开舱更换一次母鼠,开舱时间控制在10 min以内。待小鼠生长至P12时将小鼠及其哺乳母鼠放回正常环境(O2体积分数为21%)饲养5 d。
1.4 药物干预
D-NAC药物载量、纯度、稳定性以及药物释放动力学已经经过前期实验验证[15],符合实验要求。基本参数如下:动态光散射法测得D-NAC粒径为(5.3±1.8)nm,高效液相色谱法评估产物纯度大于95%;D-NAC在细胞内GSH浓度>250 μmol·L-1时释放NAC,24 h后回收率为(89.8±2.2)%。根据分组分别于P12及P14给予共两次玻璃体内注射,具体方法为:于角膜缘后2 mm处用10 μL微量注射器以45°进针入玻璃体注射,注射完毕静置15 s后缓慢撤针,其中OIR+D-NAC组小鼠右眼玻璃体内注射浓度为1 g·L-1的D-NAC 1 μL,OIR+Dendrimer组小鼠左眼玻璃体内注射浓度为1 g·L-1的Dendrimer 1 μL,正常对照组小鼠随机选择一眼玻璃体内注射生理盐水1 μL。
1.5 GSH检测
分别于P12、P13、P14、P16、P17时每组各随机选取4只小鼠经CO2窒息后颈椎脱臼法处死,摘出小鼠眼球后,弃角膜、晶状体、玻璃体和脉络膜,取出完整视网膜组织,严格按照GSH检测试盒说明书操作,检测各组小鼠视网膜中GSH含量。
1.6 视网膜荧光染色
OIR+Dendriner组和OIR+D-NAC组小鼠于P12、P14及P17时各随机选取4只经CO2窒息后颈椎脱臼法处死,分离出完整视网膜组织。将视网膜在40 g·L-1多聚甲醛中固定40 min,用体积分数10%山羊血清封闭2 h,转移至原代抗体溶液中。抗体为红色荧光Alexa FluorTM 594 同工凝集素 GS-IB 4 偶联物,溶液为含100 μmol·L-1 CaCl2和体积分数0.3%Triton的PBS。4 ℃冰箱过夜。以下所有步骤保持视网膜避光。次日在含有体积分数0.3%Triton的PBS中清洗视网膜3次。将视网膜平铺于载玻片上,滴少量甘油后加盖玻片,荧光显微镜下观察,用Photoshop软件计算各组小鼠视网膜VO面积与NV面积。
1.7 qRT-PCR检测
OIR+Dendriner组和OIR+D-NAC组小鼠在P16时各随机选取5只颈椎脱臼法处死,分离出视网膜,按照逆转录试剂盒说明书提取视网膜组织中总RNA,将RNA逆转录成cDNA,扩增后行qRT-PCR检测VEGF、VEGF受体-2(VEGFR-2)、成纤维细胞生长因子(FGF)、促血管生成素(ANGPT)、促红细胞生成素(EPO)、DLL4、Hes1、Hey1、Hey2、Notch1、NRARP mRNA的表达,以GAPDH为内参。引物均由酵母基因组数据库网站设计,由Thermo fisher公司合成。各基因引物序列见表1。使用2-ΔΔCt计算各mRNA相对表达量。
1.8 ELISA检测VEGF
OIR+Dendrimer组和OIR+D-NAC组小鼠于P16时各随机选取5只经CO2窒息后颈椎脱臼法处死,分离出完整视网膜组织,使用ELISA检测视网膜组织中的VEGF含量。将装有视网膜组织的EP管自液氮罐中取出,加入300 μL裂解液。超声裂解视网膜组织(37 ℃,超声能量调节幅度为30%,停1 s,工作1 s,共40 s),冰上静置15 min后,4 ℃ 13 000 r·min-1 离心5 min。吸取上清,用Bardford assay法测VEGF蛋白浓度。按照ELISA试剂盒说明书检测,在450 nm处检测光密度,并根据标准品换算样品浓度。



1.9 统计学分析
采用SPSS 18.0统计软件对数据进行统计学分析,所有数据以均数±标准差表示,组间两两比较采用t检验。检验水准:α=0.05。
2 结果 
2.1 D-NAC对OIR小鼠视网膜GSH水平的影响
P12、P13、P14、P16、P17时,正常对照组与OIR+Dendrimer组小鼠视网膜GSH水平相比,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。在P13和P14, OIR+D-NAC组与OIR+Dendrimer组小鼠的GSH水平相比差异无统计学意义(均为P>0.05)。在P16和P17,与OIR+Dendrimer组相比,OIR+D-NAC组小鼠视网膜中GSH水平均升高,差异均有统计学意义(t=3.45、4.45,P=0.010、0.004)(图1)。表明D-NAC可通过升高GSH水平从而清除ROS发挥抗氧化应激作用。




2.2 D-NAC对OIR小鼠视网膜血管重建的影响
在P12和P14,OIR+D-NAC组与OIR+Dendrimer组小鼠相比,视网膜VO面积差异均无统计学意义(均为P>0.05)。在P17,与OIR+Dendrimer组相比,OIR+D-NAC组小鼠视网膜VO面积显著减少,差异有统计学意义(P=0.020)。因此我们选择P17研究两组之间视网膜病理性NV的差异,结果显示,P17时,OIR+D-NAC组小鼠视网膜病理性NV面积较OIR+Dendrimer组显著减少,差异有统计学意义(P=0.040)(图2、表2)。表明D-NAC在P14~P17时促进OIR小鼠视网膜血管重建。






2.3 D-NAC对OIR小鼠视网膜NV相关因子mRNA水平的影响
qRT-PCR检测OIR小鼠视网膜中主要的NV相关因子VEGF、VEGFR-2、FGF、ANGPT、EPO mRNA水平,结果显示,在P16,与OIR+Dendrimer组相比,OIR+D-NAC组小鼠视网膜VEGF、VEGFR-2、EPO、ANGPT和FGF的mRNA水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表3)。表明D-NAC可通过抑制OIR小鼠视网膜中NV相关因子mRNA的表达发挥抑制NV的作用。


2.4 D-NAC对OIR小鼠视网膜DLL4/Notch通路相关因子mRNA水平的影响
DLL4/Notch信号通路是血管萌芽和分支的重要通路。在P16,与OIR+Dendrimer组相比,OIR+D-NAC组小鼠视网膜DLL4、Notch1、Hes1、Hey2、Hey1和NRARP mRNA水平均下调,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表4)。表明D-NAC可通过抑制DLL4/Notch信号通路发挥抑制NV的作用。


2.5 D-NAC对OIR小鼠视网膜VEGF表达的影响
ELISA检测结果显示,在P16,与OIR+Dendrimer组VEGF蛋白表达水平[(17.03±2.80) ng·g-1]相比,OIR+D-NAC组小鼠视网膜中VEGF蛋白表达水平[(9.87±2.60) ng·g-1]降低(t=8.18,P=0.001),与其mRNA表达水平一致。表明D-NAC可通过抑制OIR中VEGF蛋白表达发挥抗炎和抗病理性NV的作用。
3 讨论
氧化应激和炎症是IRs发病的主要因素。视网膜在缺血情况下最重要的是进行生理性血管重建。生理性血管生成是生理性血管发育中的血管生成和缺氧或缺血期间的血管恢复,病理性血管生成是与血管病理学和功能障碍相关的NV形成。视网膜缺血期间,ROS的产生和清除能力不平衡,ROS触发多种信号通路,导致氧化应激和炎症。因此,清除ROS显得尤为重要。抗氧化剂NAC是ROS清除剂。本研究探究NAC与纳米材料Dendrimer的聚合物D-NAC在IRs中调节血管重建的能力,结果显示,D-NAC通过抑制ROS降低NV相关因子的生成,使生理性血管闭塞减少,病理性NV减少,表明抑制ROS表达是促进IRs血管重建的关键。
ROS抑制剂D-NAC是一种调节氧化应激和炎症的有效治疗剂。在本研究中,OIR+Dendrimer组和OIR+D-NAC组小鼠P12、P14时视网膜GSH水平相近,表明在此期间两组小鼠视网膜氧化应激程度相当,这与在P14时OIR+Dendrimer组和OIR+D-NAC组小鼠视网膜的血管生成程度相当有关,说明D-NAC对缺血早期血管再生的影响较小。
在P14,OIR+D-NAC组与OIR+Dendrimer组小鼠视网膜VO面积相近,说明D-NAC对血管重建的促进作用在此时尚不明显。在 P17,OIR+D-NAC组比OIR+Dendrimer组小鼠VO面积和NV面积均明显减少,表明D-NAC促进视网膜血管重建主要发生在P14之后,通过促进生理性血管生成和抑制病理性NV,从而促进血管重建。与本研究结果一致,Saito等[16]研究表明,通过抑制ROS来源的Nox可以降低IRs中视网膜VO面积和病理性NV。
IRs病理性NV生成前有一段缺氧期,这段缺氧期会触发包括VEGF等生长因子的释放[17]。VEGF具有促血管生成、促炎和增加血管通透性作用,并且是视网膜病理性NV形成的关键因子。另有研究证实,敲除ROS的主要来源Nox后,小鼠在P17时视网膜NV和VEGF-A表达明显减少[18]。本研究发现,在P16,与OIR+Dendrimer组相比,OIR+D-NAC组小鼠视网膜VEGF及VEGFR-2 mRNA表达水平降低,且VEGF蛋白表达降低。表明缺血缺氧后ROS产生增加,进而VEGF升高导致NV形成,D-NAC通过降低ROS使VEGF表达降低,从而减少NV生成。
在视网膜血管发育过程中,DLL4/Notch通路在尖-茎细胞出芽血管生成中有典型特征[19]。尖端血管内皮细胞的丝状伪足向前延伸控制出芽,并调控邻近茎血管内皮细胞形成新的血管分支。视网膜缺血缺氧后,VEGF高表达并上调尖细胞中DLL4表达,DLL4激活邻近茎细胞中Notch信号通路,并诱导Notch靶基因表达,Notch活化下游Hes、Hey家族及NRARP表达,激活茎血管内皮细胞形成新的血管分支[20]。本研究发现,D-NAC降低了OIR小鼠视网膜DLL4/Notch通路相关基因的表达。由此推测,OIR+D-NAC组小鼠视网膜病理性NV减少的可能机制为:通过降低OIR小鼠视网膜VEGF和DLL4/Notch通路相关因子表达,从而造成尖端细胞控制的NV出芽减少,同时降低Notch下游因子Hes、Hey家族、NRARP以及VEGFR-2表达,造成茎细胞控制的NV分支减少。
4 结论
玻璃体内注射D-NAC通过抑制ROS,使OIR小鼠视网膜病理性NV形成减少、生理性NV增多,其分子机制可能是通过抑制DLL4/Notch通路来完成的。