《眼科新进展》  2024年7期 522-525   出版日期:2024-07-01   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
小鼠上丘Rap1B表达的发育性变化及关键期单眼形觉剥夺对其的影响


视觉发育是指包括眼睛和大脑在内的视觉系统发育和成熟的过程。这一过程需要视觉神经系统在一定时期内接受外界刺激逐渐发育完善[1]。在视觉发育过程中,神经可塑性在塑造视觉系统的结构和功能方面起着至关重要的作用。视觉可塑性是指视觉系统在生命早期能够通过经验和学习来改变其结构和功能[2]。目前,对视觉可塑性的研究主要集中在初级视觉皮层(V1),而忽略了上丘这一脑内第二大视觉中枢和其他视网膜投射通路相关脑区。在小鼠中,有大约90%的视网膜神经节细胞投射到上丘[3]。上丘可直接接受视网膜信号的输入,同时也接受来自大脑皮层的视觉整合信号[4],从而在视觉信息处理中发挥重要作用。目前关于上丘视觉发育可塑性的分子机制尚知之甚少。已有研究表明,Ras相关蛋白Rap1通过调节肌动蛋白细胞骨架控制树突棘的形态和功能,从而影响神经元的形态及其可塑性[5]。Rap1B是Rap1的关键亚型,但Rap1B在上丘视觉发育可塑性中的作用仍未可知。本研究旨在探讨小鼠上丘中Rap1B表达的发育性变化以及单眼形觉剥夺(MD)对其表达的影响,以期为上丘视觉发育可塑性的分子机制研究提供新的方向和思路。
1 材料与方法 
1.1 实验动物
本研究使用SPF级野生型健康雄性C57BL/6J小鼠45只,年龄分别为出生后18 d(P18)、28 d(P28)、32 d(P32)、60 d(P60),均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。小鼠在正常的12 h光照/12 h黑暗循环环境中饲养,室温20~26 ℃,相对湿度为40%~70%,食物和水可随意获得。本研究实验动物饲养和使用符合3R原则,获得天津医科大学实验动物伦理委员会批准(批号:TMUaMEC2022004)。
1.2 主要试剂
兔抗Rap1B抗体(mAb#2326,美国Cell Signaling Technology公司),兔抗GAPDH抗体(ab9485)、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(ab6721)(美国Abcam公司)。RIPA裂解液(P0013B,上海碧云天生物技术有限公司),蛋白酶抑制剂(HY-K0010,美国MCE公司),PAGE凝胶快速制备试剂盒(PG114,上海雅酶生物医药科技公司),BCA 蛋白检测试剂盒(23227,美国Thermo Scientific公司),超敏ECL化学发光检测试剂盒(PK10003,美国Proteintech公司)。
1.3 方法 
1.3.1 实验动物分组
实验一:研究小鼠上丘中Rap1B基因表达的发育性变化。实验分为3组:关键期前组(P18小鼠)、关键期组(P32小鼠)和成年组(P60小鼠),采用qPCR(每组6只)和Western blot(每组3只)检测各组小鼠左右两侧上丘中Rap1B基因和蛋白的表达量。实验二:研究MD对上丘中Rap1B基因及其蛋白表达的影响。实验分为2组:右眼MD组(小鼠P28时右眼建立MD模型,至P32时行检测)和NC组(P32正常小鼠),采用qPCR(每组6只)和Western blot(每组3只)检测各组小鼠左右两侧上丘中Rap1B基因和蛋白的表达量。各组别小鼠麻醉后取出完整脑组织,在显微镜下依据《小鼠大脑立体定位图谱》取出小鼠左右两侧上丘组织。
1.3.2 MD模型建立
右眼MD组取P28小鼠麻醉后,修剪右眼的上下眼睑睑缘,然后褥式缝合上下眼睑。术后每天涂典必殊眼膏,连续4 d,以防止感染和炎症。同时,每天检查缝线是否开口,如发现开线则该只小鼠不能再继续纳入实验。于P32时同NC组取出完整脑组织进行分子生物学实验。
1.3.3 qPCR检测
使用组织RNA提取试剂盒(EZBioscience?),从小鼠上丘分离总RNA。使用cDNA合成试剂盒(Vazyme)合成cDNA。在LightCycler?96(Roche)实时PCR系统上用TB Green? Premix Ex TaqTM(TaKaRa)进行qPCR检测,以GAPDH为内参。Rap1B上游引物为5’-GTG AAT ATA AGC TCG TCG TGC-3’,下游引物为5’-ACA CTG CTG TGC ATC TAC TTC-3’;GAPDH上游引物为5’-TGG CCT TCC GTG TTC CTA C-3’,下游引物为5’-GAG TTG CTG TTG AAG TCG CA-3’。
1.3.4 Western blot检测
取小鼠左右两侧上丘组织,加入RIPA裂解液(强)与蛋白酶抑制剂,用超声法使所有组织全部溶解,BCA法进行总蛋白定量,在150 g·L-1 SDS凝胶上进行电泳。电泳结束后,在4 ℃,250 mA下持续90 min转膜,将蛋白质转移至Immobilon-P 0.45 μm膜(Millipore)上,将膜在含有体积分数5%的脱脂牛奶中室温下封闭2 h,而后将膜与一抗在4 ℃摇床下孵育过夜。彻底洗涤后,将膜与过氧化物酶结合的二抗在室温下孵育2 h,彻底洗涤,并使用化学发光底物显色。使用ImageJ通过光密度测定法定量Rap1B相对于GAPDH的蛋白表达量。
1.4 统计学方法
采用GraphPad Prism 9.1.1统计软件进行数据分析。数据均进行正态分布检验,结果以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用两独立样本t检验。检验水准:α=0.05。
2 结果 
2.1 上丘Rap1B表达的发育性变化研究
关键期前组小鼠左右两侧上丘中Rap1B基因和蛋白表达均微弱,随着小鼠生长发育,关键期组小鼠左右两侧上丘中Rap1B基因和蛋白表达均显著增高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);此后随着小鼠天龄的增加,Rap1B基因和蛋白表达均降低,至成年组小鼠左右两侧上丘中Rap1B基因和蛋白表达均较关键期组降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1-2,图1-2)。












2.2 MD对上丘Rap1B基因和蛋白表达的影响
右眼MD组与NC组小鼠相比,左侧上丘中Rap1B基因和蛋白表达均升高,而右侧上丘中Rap1B基因和蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表3-4,图3-4)。











3 讨论
弱视是指在儿童视觉发育早期由于单眼斜视、屈光参差、高度屈光不正及形觉剥夺等异常视觉经验而导致的单眼或双眼视力受损的一种视觉神经系统发育异常疾病[6]。研究表明,弱视的发生机制与视觉可塑性密切相关[7]。树突棘是视觉神经系统发生可塑性变化的结构载体。树突棘是神经元树突上的特殊突起。研究表明,动态的肌动蛋白细胞骨架使树突棘具有形态延展性[8]。树突棘可以对各种刺激做出快速重组,包括依赖经验的学习[9]。已有研究发现,关键期内MD这一异常视觉经验会导致小鼠视皮层树突棘丧失[10]。此外,有研究表明,Rap1的活性对树突棘具有调节作用,通过抑制海马体中Rap1活性会促进神经元树突棘的生长[11],而激活Rap1则会抑制神经元树突棘的生长[12]。本研究的Western blot与qPCR检测结果均显示,在进行右眼MD后会增加左侧上丘Rap1B的表达,提示其可能会抑制上丘树突棘的形成。与之相反,右眼MD后同时降低了右侧上丘Rap1B的表达。左右两侧上丘中Rap1B表达趋势相反的原因可能与在小鼠视觉系统中从视网膜到两侧上丘的投射不均等即存在对侧输入优势,以及Rap1B对上丘神经元树突棘的双向调控有关。视觉发育关键期MD可引起来自双眼的视觉信号输入的改变,可导致视觉神经系统神经元对剥夺眼输入反应的减弱,同时增强了对未被剥夺眼输入的反应[13]。相应的在神经元结构可塑性方面,与剥夺眼输入相关的树突棘的形成被减弱,而与未剥夺眼输入相关的树突棘的形成得到加强。既往在视皮层的研究表明,在视觉发育关键期行MD,可促进非剥夺眼到V1神经元输入的数量[14]。而在上丘中,由于存在更为显著的对侧输入优势,从而在右侧上丘中来自非剥夺眼输入相关的树突棘的增强较来自剥夺眼输入相关的树突棘的减弱更为明显。
有研究已证实,在培养的皮层神经元中激活的Rap1可诱导树突棘颈部伸长,从而形成细棘[15],而细棘是几种智力障碍病的特征[16]。在这些疾病中,高度动态和不稳定的细棘可能占主导地位,导致缺乏进行稳定突触接触的能力,最终导致认知障碍。本研究小鼠在关键期行右眼MD后,右眼输入占优势的左侧上丘中Rap1B表达增加,提示弱视可能与高度动态和不稳定的细棘占主导地位有关。
视觉系统在视觉发育阶段具有明显的可塑性。小鼠活体成像研究显示,皮层锥体神经元在发育过程中会发生广泛的树突棘重塑,这种发育特性通过棘增加和棘消除进行平衡调节[17-19]。这种平衡调节与Rap1的活性密切相关[12]。本研究发现,正常P18小鼠左右两侧上丘中Rap1B表达量微弱,随着小鼠生长发育,正常P32小鼠上丘中Rap1B的表达量显著增高,而到了成年期,正常P60小鼠上丘中Rap1B的表达量减少,表明小鼠左右两侧上丘中Rap1B表达的发育性变化趋势与视觉发育关键期一致,提示Rap1B可能通过对上丘树突棘的调节来参与视觉发育的可塑性变化。
4 结论
小鼠上丘Rap1B表达量在视觉发育关键期内明显高于幼年与成年,小鼠上丘中Rap1B基因表达的发育性变化趋势与视觉发育关键期相一致,这提示Rap1B参与了视觉发育可塑性的调节。同时,在关键期右眼MD小鼠左侧上丘Rap1B表达量升高而右侧上丘Rap1B表达量降低,提示Rap1B可能参与了异常视觉经验对上丘发育可塑性的双向调控。