《眼科新进展》  2024年7期 517-521   出版日期:2024-07-01   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
视觉发育关键期单眼剥夺对小鼠大脑不同区域星形胶质细胞的影响


星形胶质细胞(Astrocyte)是最大的神经胶质细胞,主要存在于中枢神经系统(CNS),是正常大脑环境中不可或缺的组成成分,为神经元提供营养支持,调节神经递质的释放进行信号转导以调节神经元活动[1]。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)是星形胶质细胞骨架的主要组成部分,在蛋白质水平高度异质,是最常用的星形胶质细胞标记物[2],并且可随着损伤和疾病的反应而发生巨大变化[1]。无论是面对急性损伤,如感染(细菌、病毒、寄生虫)还是慢性疾病,星形胶质细胞都能迅速反应[1]。在大脑发育过程中,皮层回路通过突触发生、成熟和修剪等过程而建立。星形胶质细胞在每个阶段发挥不同作用,从而促进复杂网络回路的形成[3]。在视觉发育关键期行单眼剥夺(MD)可引起眼优势转移,从而导致视觉神经环路发生变化。本研究采用逆转录实时荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)、Western blot和免疫荧光染色检测视觉发育关键期内行MD后,小鼠上丘(SC)、海马(Hippocampus)和视皮层(Visual cortex)星形胶质细胞表达的变化,为进一步研究星形胶质细胞在视觉发育可塑性中的作用提供依据。
1 材料与方法 
1.1 实验动物及分组
27 d龄健康C57BL/6J小鼠18只(北京斯贝福生物技术有限公司),体重约为13 g,在12 h/12 h昼夜循环环境中饲养,自由饮食和进水,温度(24±0.5)℃,湿度(55±5)%。小鼠随机分为正常对照组(CON组)和MD组,每组各9只 。本研究所有实验条件和程序均遵循天津市医学实验动物保护中心的指导原则,动物处理遵循《实验动物管理条例》(2017修订版)的规定。
1.2 主要试剂及仪器
兔抗中枢神经特异性蛋白(S100β)抗体(英国Abcam公司),鼠抗GFAP抗体(美国CST公司),RNA提取试剂盒(上海海方生物技术有限公司),逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)预混液(加拿大ABM公司), 蛋白预染Marker、超敏ECL化学发光检测试剂盒、CoraLite488标记山羊抗兔二抗、CoraLite594标记山羊抗鼠二抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠二抗(武汉三鹰生物技术有限公司),40 g·L-1多聚甲醛(北京索莱宝科技有限公司),RIPA蛋白裂解液(上海碧云天技术股份有限公司)。荧光共聚焦显微镜(德国徕卡公司)。
1.3 方法 
1.3.1 MD动物模型的建立及饲养
MD组取9只小鼠在生后27 d对右眼进行MD 7 d。小鼠称重后麻醉,使用碘伏消毒右眼周围皮肤,分别剪除右眼上下眼睑缘各1 mm组织,并用8-0可吸收线缝合。术后涂抗生素眼膏并检查创口情况,避免创口感染及缝线脱落。
1.3.2 免疫荧光染色检测星形胶质细胞GFAP和S100β共定位的细胞数
造模结束当天下午,每组各取3只小鼠,称重后麻醉,进行灌注取脑。剪开前胸壁充分暴露心脏,剪开右心耳,经心-升主动脉插管灌注固定:将注射针头插入小鼠心尖,先快速灌注PBS至小鼠两肺变白,而后改为40 g·L-1多聚甲醛灌注。继而打开颅骨,分别剥取两组小鼠左侧脑组织,放入40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h。固定结束后,振动切片机对脑组织进行切片,厚度为100 μm,参照小鼠脑图谱分别筛选含有视皮层、上丘和海马组织的切片,放入含PBS的24孔板中。用体积分数5%牛血清白蛋白(BSA)和1 g·L-1 Triton X-100的PBS封闭1 h后,加入鼠抗GFAP抗体和兔抗S100β抗体在4 ℃摇床共同孵育过夜,次日PBS洗3次,每次5 min。加入CoraLite488标记山羊抗兔和CoraLite594标记山羊抗鼠荧光二抗,室温下共同孵育2 h,避光,PBS洗3次,每次5 min。加入DAPI孵育8 min,PBS洗2次,每次5 min。50%甘油封片。每组对每个脑组织选取2~3张切片拍摄,参照小鼠脑图谱确定上丘、海马、视皮层的位置(图1)。使用ImageJ手动计数各组共定位的细胞。



1.3.3 Western blot检测星形胶质细胞GFAP蛋白表达
造模结束当天下午,每组各取3只小鼠,称重后麻醉,迅速断头取脑并参照小鼠脑图谱分离左侧上丘、海马、视皮层,检测各组小鼠GFAP蛋白表达情况。每份样本加入170 μL RIPA蛋白裂解液和1.7 μL蛋白酶抑制剂,冰上超声裂解,离心后取上清液,加入5×蛋白上样缓冲液,用量为上清液的1/4,混匀后于100 ℃加热10 min,冷却至室温。BCA法测定上清液中总蛋白浓度,取30 μg总蛋白上样,行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳、转膜,体积分数5%脱脂牛奶室温封闭2 h,加入鼠抗GFAP抗体,4 ℃冰箱孵育过夜。次日使用TBST洗膜3次,每次10 min,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠二抗室温孵育2 h,TBST洗膜3次,每次10 min,进行ECL化学发光检测。随后用同样方法孵育并曝光内参GAPDH。使用ImageJ对GFAP和GAPDH的条带进行灰度分析,GFAP蛋白相对表达量=GFAP条带灰度值/GAPDH条带灰度值。
1.3.4 RT-qPCR检测星形胶质细胞GFAP mRNA表达
每组各取3只小鼠,分离上丘、海马、视皮层,方法同上。随后按照RNA提取试剂盒的说明提取总RNA,使用逆转录试剂盒合成cDNA。按照qPCR预混液使用说明进行RT-qPCR检测,引物序列如下:GFAP正向引物为5’-GCGAAGAAAACCGCATCACC-3’,反向引物为5’-CAGGCTGGTTTCTCGGATCT-3’,GAPDH正向引物为5’-TGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3’,反向引物为5’-GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA-3’。结果采用2-ΔΔCt法进行计算,将CON组小鼠上丘、海马、视皮层星形胶质细胞GFAP表达归一化记为1。检测MD组小鼠GFAP mRNA相对表达。
1.4 统计学分析
使用GraphPad Prism 9.0软件进行统计分析。经正态性检验和方差齐性检验后,正态分布的计量资料用x?±s表示,两组间的比较采用独立样本t检验,检验水准:α=0.05。
2 结果 
2.1 两组小鼠星形胶质细胞GFAP mRNA的表达
RT-qPCR检测结果显示,MD组小鼠上丘、海马、视皮层星形胶质细胞的GFAP mRNA相对表达量分别为0.53±0.04、0.66±0.07、0.59±0.09。与CON组(归一化为1)相比,MD组小鼠大脑各区域GFAP mRNA的表达均明显减少(均为P<0.05)。
2.2 两组小鼠星形胶质细胞GFAP蛋白的表达
Western blot 检测结果显示,CON组小鼠上丘、海马、视皮层星形胶质细胞GFAP蛋白相对表达量分别为1.12±0.17、1.23±0.07、1.33±0.02,MD组分别为0.65±0.19、0.81±0.14、1.04±0.18,与CON组相比,MD组小鼠大脑各区域GFAP蛋白表达均减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图2)。



2.3 两组小鼠GFAP和S100β共定位的星形胶质细胞数
免疫荧光染色结果显示,MD组小鼠上丘、视皮层GFAP和S100β共定位的细胞数分别为(4.22±1.99)个、(12.33±2.60)个,海马锥体细胞1(CA1)区、海马锥体细胞3(CA3)区、海马齿状回(DG)区三个区域GFAP和S100β共定位的细胞数分别为(21.13±4.45)个、(10.38±3.02)个、(10.50±3.34)个,均低于CON组[上丘:(10.78±3.27)个,视皮层:(22.00±6.46)个,海马CA1区:(35.57±1.51)个,海马CA3区:(25.00±7.37)个,海马DG区:(27.71±3.04)个],差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3-7)。















3 讨论
小鼠出生后的早期发育存在一个关键期,在此期间,感觉体验如视觉、触觉、听觉等对于神经回路形成和重塑发挥重要作用[4]。在视觉发育关键期剥夺一眼的视觉输入会导致眼优势偏移至非剥夺眼,引起视功能发育异常[5]。有研究根据眼优势可塑性将小鼠的关键期定义为出生后3~5周[6-7],小鼠初级视皮层的眼优势可塑性在4周龄时最大[7-8],Hofer等[9]研究结果表明,在小鼠生后28 d进行MD 4~10 d,眼优势即发生转移。
星形胶质细胞是脑内数量最多,功能最复杂的胶质细胞。在发育中的大脑,神经回路精细化通过突触发生、成熟、修剪实现,星形胶质细胞参与此过程的各个阶段[3]。此外,星形胶质细胞摄取突触释放的多种神经递质,是谷氨酸和γ-氨基丁酸代谢的主要场所,CNS的大部分细胞外谷氨酸的消除都是由星形胶质细胞介导的[10]。星形胶质细胞的减少,必然会影响这些脑区的信息传递和神经网络的发育与成熟。
哺乳动物大脑中的视觉空间感知通过两条平行的途径发生:一条通过丘脑到达初级视觉皮层,另一条通过视网膜的直接投射到达上丘[11]。当哺乳动物睁眼后,视皮层整合视觉信息调节视觉回路的形成和重塑,视觉体验在视皮层发育过程中逐渐占据主要地位[12]。用于多感觉整合的神经元在中脑上丘中逐渐发育成熟。Wallace等[13]研究结果表明,在早期发育阶段,视觉体验对于上丘整合视、听、触多感官信息的能力至关重要。
丰富环境指能增加感觉、运动、认知及社交刺激的居住条件[14]。有研究结果表明[15],大鼠在丰富环境中饲养4~10 d,视皮层免疫组织化学结果显示,星形胶质细胞密度增加,自出生开始长时间的暗环境饲养后对猫视皮层行免疫荧光染色,发现猫视皮层GFAP免疫反应性降低[16];大鼠暗环境饲养至35 d,GFAP蛋白表达也降低[17]。以上研究结果表明,视皮层星形胶质细胞数量的变化与视觉体验密切相关。
本研究采用RT-qPCR、Western blot、免疫荧光染色方法,从mRNA和蛋白表达方面验证MD后上丘、海马、视皮层星形胶质细胞数量的变化,结果显示,与CON组相比,MD组小鼠星形胶质细胞GFAP mRNA和蛋白表达不仅在上丘和视皮层表达减少,在未参与视觉处理的海马体表达也减少。这表明视觉剥夺对星形胶质细胞的影响不仅局限于视皮层,对未参与视觉处理的海马区域也有影响。海马体是一种参与学习的颞叶结构,由CA1、CA2、CA3和DG亚区组成,对信息编码、存储和检索非常重要[18],能接受来自多种感觉信息的输入[19]。Corvetti等[20]研究结果表明,暗环境饲养使GFAP标记的星形胶质细胞在视皮层、海马、运动皮层分别减少80%、50%、50%,尽管他们发现视觉剥夺对运动皮层和海马的影响比视皮层小,但也表明暗环境饲养这一视觉剥夺形式对星形胶质细胞的影响涉及CNS的整体调节[20]。星形胶质细胞的突起同突触前和突触后神经元形成三方突触,单个星形胶质细胞可以通过其精细突起接触超过100 000个突触[2],与神经元突触形成密切接触,包绕神经递质释放的部位并调节突触效力和可塑性[21],以应对外界环境变化。因此,神经元与星形胶质细胞间的交流可能是使海马这一非视觉处理区域在MD后产生变化的原因。
然而也有部分研究发现暗环境饲养或MD并不能使星形胶质细胞数量发生变化。Wang等[22]对生后21 d的小鼠进行MD或暗环境饲养4 d,GFAP和S100β免疫荧光染色共定位结果显示,星形胶质细胞数量没有发生变化,但暗环境饲养14 d的星形胶质细胞数量减少。因此推测,若MD或暗环境饲养的时间较短,则不足以使星形胶质细胞数量发生变化。我们对视觉发育关键期小鼠进行了长达7 d的MD,发现星形胶质细胞数量减少,证明7 d这一剥夺时间足以对视觉发育关键期小鼠视皮层星形胶质细胞产生影响。
4 结论
星形胶质细胞是关键期大脑发育所必需的。我们对视觉发育关键期小鼠进行MD后,上丘、海马、视皮层的星形胶质细胞数量均减少,这表明它参与了大脑多个区域神经回路的重塑,能对MD导致的双眼输入不平衡做出反应。星形胶质细胞功能多样,一旦发生改变会产生众多连锁效应。本研究结果为进一步研究星形胶质细胞在视觉发育乃至其他脑区的功能提供依据。