《眼科新进展》  2024年7期 512-517   出版日期:2024-07-01   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
胰岛素样生长因子1对人RPE细胞分泌TGF-β2、MMP-2的影响及机制研究


近视是临床上常见的一种屈光不正,是指在调节放松的状态下,外界平行光线经过眼屈光介质成像于视网膜之前,造成视远不清的现象。国际近视协会将调节放松时等效球镜度≤-0.50 D归类为近视,等效球镜度≤-6.00 D归类为高度近视[1]。近视尤其是高度近视可能有发生视网膜脱离、黄斑病变、青光眼等并发症的风险,严重危害视觉健康。目前研究表明,近视的发生主要通过局部“视网膜-脉络膜-巩膜”途径进行信号传递,导致巩膜主动重塑,眼轴伸长而发生近视。除遗传因素以外,外界对视网膜的刺激信号来源多样,光环境、用眼习惯、睡眠、饮食等多种环境因素均是影响早期近视发展的关键[2],其中饮食因素对近视的发生起着重要作用。随着社会经济的发展和生活水平的提高,人们的饮食多为高糖、高脂模式,长期高糖摄入会引起机体胰岛素敏感性下降,使胰岛素样生长因子1(IGF-1)的游离含量升高[3]。近年研究发现高糖与近视相关的信号通路类型众多[4-6],其中磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)通路在近视动物模型中表达持续升高,并与转化生长因子β2(TGF-β2)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)等近视信号因子有关[7-9],提示IGF-1可能通过PI3K/AKT通路调控TGF-β2、MMP-2表达,从而参与近视的发展。本研究将通过体外培养人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19),研究IGF-1对细胞增殖、迁移及分泌TGF-β2、MMP-2的影响,并初步探讨其作用机制,以期为明确近视的发病机制提供新的思路。
1 材料与方法 
1.1 材料 
1.1.1 细胞来源
ARPE-19细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。
1.1.2 主要试剂与仪器
胎牛血清、DMEM/F12基础培养基、青-链霉素、0.5 g·L-1胰蛋白酶(美国Gibco公司);IGF-1、PI3K/AKT通路抑制剂LY294002(美国MCE公司);TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT抗体(武汉三鹰生物科技有限公司);BCA蛋白浓度定量试剂盒(上海碧云天试剂公司);ELISA试剂盒(睿信生物科技有限公司);逆转录试剂盒(莫纳生物科技有限公司);CCK-8试剂盒(美国Glpbio公司);CO2培养箱(美国赛默公司);聚合酶链式反应PCR仪(美国ABI公司);酶标仪(德国艾本德公司);倒置显微镜(日本尼康映像仪器销售公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养

ARPE-19细胞使用完全培养基(DMEM/F12基础培养基+体积分数10%胎牛血清),于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱中培养,待细胞融合至80%左右传代。取复苏后2~5代对数生长期的ARPE-19细胞用于后续实验。
1.2.2 CCK-8法检测IGF-1、LY294002对ARPE-19细胞活力的影响
取对数生长期ARPE-19细胞,以每孔4×103个·mL-1细胞接种于96孔板,将细胞按照不同浓度(0 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1、100 μg·L-1、160 μg·L-1)IGF-1和不同浓度(0 mmol·L-1、20 mmol·L-1、30 mmol·L-1、40 mmol·L-1、50 mmol·L-1)LY294002培养,每组均设3个以上复孔,采用无血清DMEM/F12培养基培养6 h、12 h、24 h、48 h,弃上清,每孔加入100 μL含体积分数10%CCK-8溶液的无血清DMEM/F12培养基,37 ℃孵育2 h,检测每组细胞450 nm处OD值,取均值计算细胞活力,确定IGF-1、LY294002在ELISA、RT-PCR、Western blot实验中的最佳作用浓度与时间。
1.2.3 细胞划痕法检测IGF-1对ARPE-19细胞迁移的影响
用记号笔在6孔板背面画5条横线,间距约1 cm。取对数生长期ARPE-19细胞,以每孔2×105 个·mL-1细胞接种于6孔板,细胞贴壁后用10 μL枪头垂直于背面的横线划痕,PBS洗3次,每次1 min,除去脱落的细胞。将细胞分为0 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1 IGF-1组,由于细胞生长速度较快,选择细胞培养12 h时在倒置显微镜下观察并拍照,使用ImageJ软件分析,计算每组细胞迁移率。细胞迁移率=(0 h划痕面积-12 h划痕面积)/0 h划痕面积×100%。
1.2.4 ELISA检测IGF-1对ARPE-19细胞外分泌TGF-β2的影响
IGF-1培养ARPE-19细胞24 h,收集0 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1 IGF-1组细胞上清液,4 ℃ 4 000 r·min-1离心20 min。根据TGF-β2的ELISA试剂盒说明书操作,450 nm处检测各组细胞OD值,根据TGF-β2标准品浓度曲线方程,计算各组细胞上清液中TGF-β2的浓度。
1.2.5 RT-PCR检测IGF-1对ARPE-19细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT mRNA表达水平的影响
取对数生长期ARPE-19细胞,以每孔1.5×105个·mL-1细胞接种于6孔板,将细胞分为对照组、IGF-1组(80 μg·L-1 IGF-1)、IGF-1+LY294002组(80 μg·L-1 IGF-1+30 mmol·L-1 LY294002)、LY294002组(30 mmol·L-1 LY294002),使用无血清DMEM/F12培养基培养24 h,其中对照组不做任何处理。采用Trizol法提取细胞总RNA,核酸检测仪测定各组总RNA浓度,使用逆转录试剂盒合成第一链cDNA。按cDNA 1.0 μL、正反向引物各1.0 μL、PCR扩增预混液10.0 μL、ddH2O 7.0 μL配制反应体系进行扩增,PCR仪反应程序:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸15 s,72 ℃终延伸5 min,循环25次。扩增结束后,进行RT-PCR凝胶电泳,并拍照记录。采用ImageJ软件分析,以GAPDH为内参计算各组ARPE-19细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT的mRNA表达水平。引物序列见表1。


1.2.6 Western blot检测IGF-1对ARPE-19细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT 蛋白表达水平的影响
取IGF-1、LY294002培养24 h的ARPE-19细胞(分组方法同1.2.5),充分裂解各组细胞,4 ℃ 12 000 r·min-1离心30 min后取上清,BCA试剂盒检测蛋白浓度,加入4×蛋白上样缓冲液,100 ℃煮沸10 min,等量的总蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜,使用体积分数5%的脱脂牛奶封闭膜1 h,4 ℃过夜孵育一抗(TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT),室温孵育HRP二抗2 h。显影曝光,使用ImageJ软件分析,以GAPDH为内参计算各组ARPE-19细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT的蛋白表达水平。
1.3 统计学分析
采用GraphPad Prism 9统计学软件进行分析。每项实验至少重复三次,数据以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,两组间比较采用t检验,检验水准:α=0.05。
2 结果 
2.1 CCK-8法检测IGF-1、LY294002对ARPE-19细胞活力的影响
不同浓度IGF-1培养ARPE-19细胞6 h时,细胞活力差异无统计学意义(P>0.05)。培养12 h、24 h、48 h时,不同浓度IGF-1的细胞活力逐渐升高,其中80 μg·L-1 IGF-1的细胞活力均达到了所在时间点峰值,与0 μg·L-1 IGF-1比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05),24 h时趋势更明显,确定IGF-1浓度为80 μg·L-1,培养时间为24 h(图1A)。
不同浓度LY294002培养ARPE-19细胞6 h、12 h、24 h、48 h时,细胞活力随培养时间的延长逐渐降低,与0 mmol·L-1 LY294002比较,其余各浓度LY294002的细胞活力差异均有统计学意义(均为P<0.05),其中24 h的30 mmol·L-1 LY294002接近半数抑制浓度,故确定LY294002的浓度为30 mmol·L-1,培养时间为24 h(图1B)。


2.2 细胞划痕法检测IGF-1对ARPE-19细胞迁移的影响
细胞划痕法检测结果显示,IGF-1培养ARPE-19细胞12 h,0 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1 IGF-1组细胞迁移率分别为(3.63±1.30)%、(20.23±0.28)%、(32.95±0.80)%,IGF-1明显促进了细胞迁移,且细胞迁移率随着IGF-1浓度的升高而升高,三组间整体比较及两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图2)。



2.3 ELISA检测IGF-1对ARPE-19细胞外分泌TGF-β2的影响
ELISA检测结果显示,IGF-1培养ARPE-19细胞24 h,0 μg·L-1、40 μg·L-1、80 μg·L-1 IGF-1组细胞上清液中TGF-β2的浓度分别为(0.135±0.001)pg·L-1、(0.147±0.001)pg·L-1、(0.165±0.001)pg·L-1,TGF-β2浓度随着IGF-1浓度升高而升高,三组间整体比较及两两比较差异均有统计学意义(均为P<0.05)。
2.4 RT-PCR检测IGF-1对ARPE-19细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT mRNA表达水平的影响
RT-PCR检测结果显示,IGF-1、LY294002培养24 h,与对照组比较,IGF-1组细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT mRNA表达水平均升高,LY294002组细胞中mRNA表达水平均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与IGF-1组比较,IGF-1+LY294002组细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT mRNA表达水平均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3A、C)。
2.5 Western blot检测IGF-1对ARPE-19细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT蛋白表达水平的影响
Western blot检测结果显示,IGF-1、LY294002培养24 h,与对照组比较,IGF-1组细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT蛋白表达水平均升高,LY294002组细胞中以上蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与IGF-1组比较,IGF-1+LY294002组细胞中TGF-β2、MMP-2、PI3K、AKT蛋白表达水平均下降,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3B、D)。


3 讨论
IGF-1是一种调控细胞增殖、分化及凋亡的重要生长因子,能在人视网膜、巩膜组织中广泛表达,与眼部多种疾病包括近视的发生与发展密切相关[10]。目前研究已证实,近视发生过程中,眼内IGF-1的表达水平显著升高,并伴随眼轴增长[11-12]。IGF-1主要是与细胞表面的IGF-1受体结合,参与多种信号通路,但IGF-1会引起哪些近视相关因子的改变仍有待研究。眼内TGF-β2、MMP-2受内源性信号调节及外部药物调节,其表达异常与近视性巩膜重塑密切相关。在IGF-1的作用下,TGF-β2、MMP-2的表现可能是近视形成与发展的重要机制。因此,本研究拟使用IGF-1体外培养ARPE-19细胞,探索IGF-1对细胞增殖、迁移及分泌TGF-β2、MMP-2的影响和作用机制。
TGF-β2是调控眼球及后极部巩膜生长的重要生长因子,在视网膜色素上皮层、巩膜等眼内组织中广泛表达[13-15]。研究证实,在实验性近视动物模型和人类近视患者眼内均存在TGF-β2的高表达[16-17]。MMP-2是一种能降解巩膜Ⅰ型胶原的蛋白水解酶,可被基质金属蛋白酶抑制因子抑制,此两者之间的动态平衡对近视的发生起重要作用[18]。本研究结果显示,IGF-1培养的ARPE-19细胞中TGF-β2、MMP-2的mRNA和蛋白表达水平均显著升高,ELISA检测其细胞上清液中TGF-β2表达水平也显著升高,提示IGF-1可能通过调控TGF-β2、MMP-2而参与近视的发展。Liu等[11]研究表明,IGF-1能通过信号转导因子和转录激活因子3通路上调近视豚鼠巩膜中MMP-2的表达,与本研究结果相符。有研究表明,IGF-1能保护人原代培养的RPE细胞免受氧化损伤,并促进细胞存活[19]。在本研究中,使用IGF-1体外培养ARPE-19细胞,细胞活力、迁移率均升高,表明IGF-1对ARPE-19细胞的增殖与迁移具有促进作用,与以往研究结果相符。
此外,本研究结果发现,IGF-1使ARPE-19细胞中PI3K、AKT的表达水平显著升高,而PI3K/AKT通路是IGF-1的常见信号转导途径,在近视动物模型中发现PI3K/AKT通路被激活,其通路相关蛋白表达水平持续升高[7-8,20]。因此,本研究推测IGF-1可能通过激活PI3K/AKT通路参与近视的发展过程,而阻断PI3K/AKT通路,或可以抑制IGF-1对TGF-β2、MMP-2的上调作用。
为进一步验证PI3K/AKT通路在IGF-1促进近视中的关键机制,本研究在使用IGF-1培养细胞的同时,加入PI3K/AKT通路的特异性抑制剂LY294002对该通路进行阻断,结果显示,加入LY294002后TGF-β2、MMP-2的表达水平与对照组比较明显下调,IGF-1+LY294002组的TGF-β2、MMP-2表达水平也比IGF-1组降低,表明PI3K/AKT通路能介导IGF-1上调ARPE-19细胞中TGF-β2、MMP-2的表达。
4 结论
IGF-1能促进ARPE-19细胞增殖、迁移;IGF-1可能通过PI3K/AKT通路上调ARPE-19细胞中TGF-β2、MMP-2的表达,参与近视的发生与发展。但由于本研究是基于体外培养的细胞模型而展开,具有一定的局限性,仍需进行体内研究,才能阐明IGF-1在近视发展过程中的作用机制,为近视的防控提供新的线索。