《眼科新进展》  2024年6期 464-469   出版日期:2024-06-03   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
糖尿病视网膜病变患者疾病进展与房水细胞因子的相关性研究


糖尿病性视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的微血管病变之一,是导致工作年龄人群视力损害的主要原因。DR的产生可能是慢性视网膜血管病变引起视网膜血管闭塞导致视网膜血流不足、血-视网膜屏障破坏等多重作用的结果。糖尿病性黄斑水肿(DME)可发生在DR的任一病变阶段,是糖尿病患者视力受损的常见原因之一,其发病机制主要是由于糖尿病后视网膜微血管病变,导致视网膜血管通透性增加,引起细胞外液积聚硬性渗出沉积,造成以黄斑中心凹为一个视盘直径范围内的视网膜增厚。血管内皮生长因子(VEGF)是调节血管渗透性的重要因子,在DR的发生中起到重要作用[1]。除VEGF外,有研究表明,在DR的发病过程中,多种炎症相关细胞因子共同参与、互相影响,导致血-视网膜屏障破坏,从而加重了DR的进展[2]。房水及玻璃体液中的VEGF及相关细胞因子与视网膜病变程度有明显的相关性,但目前不同细胞因子水平与抗VEGF治疗的相关性及其预测价值尚不十分明确[3]。基于此,本研究对DR患者进行前瞻性研究,探讨房水中VEGF、胎盘生长因子(PLGF)、白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-23及IL-17A水平与DR治疗的敏感性和预后效果,以期为DR患者的临床治疗方案选择提供参考。
1 资料与方法 
1.1 临床资料
选取2023年7月至2023年12月新乡医学院第三附属医院眼科行抗VEGF治疗的50例56眼DR患者进行前瞻性分析,患者年龄38~80岁,其中男33例,女23例,糖尿病病程2~15年,糖化血红蛋白水平(8.26±0.90)%。纳入标准:(1)符合2型糖尿病的诊断;(2)散瞳后经前置镜查眼底等眼科专项检查确诊为DR,且治疗前及随访期间眼部检查资料完整;(3)经荧光素眼底血管造影及光学相干断层扫描(OCT) 证实存在DME,或B超提示存在增生型DR(PDR);(4)DME患者黄斑中心凹厚度(CMT)≥250 μm,视网膜无增生性改变。排除标准:(1) 近3个月内曾接受过眼科手术,如玻璃体注药或视网膜激光光凝术等;(2) 有DR以外的其他眼底疾病,如视网膜大动脉瘤、视网膜静脉阻塞、年龄相关性黄斑变性等引起的黄斑水肿等;(3) 存在凝血功能障碍等其他手术禁忌证者;(4)不同意进行取样及房水检测,或随访期间依从性差导致眼部检测资料不全者;(5)全身情况差导致无法进行手术者。本研究通过新乡医学院第三附属医院机构审查委员会批准(批号:k2023-087-01),并遵守《赫尔辛基宣言》的原则,收集标本和临床数据以供后续分析。
1.2 方法 
1.2.1 分组
根据《糖尿病视网膜病变的国际临床分级标准》[4],将接受抗VEGF治疗的DR患者分为DME组(30例36眼)和PDR组(20例20眼)。DME组患者每月注射阿柏西普眼内注射溶液1次,连续3次,PDR组患者在行玻璃体切割术前1周注射阿柏西普眼内注射溶液1次,行玻璃体切割术时再次抽取房水用以后续比较。
1.2.2 眼科检查
术前、术后检测患者视力、眼压、眼前节及眼底等情况并做记录。所有患者治疗前后均由同一医师采用国际标准视力表检查最佳矫正视力(BCVA)。由同一医师使用尼德克非接触电脑眼压计测量眼压,取3次结果平均值。采用裂隙灯联合VOLK90D前置镜行眼前节及眼底检查。DME组行OCT(TOPCON DRI OCT Triton)及视网膜荧光造影(康佳)检查,每次OCT检查均需测量CMT,PDR组行B超检查。
1.2.3 术前准备
术前3天所有患者术眼局部点用左氧氟沙星滴眼液,每天4次,术前使用9 g·L-1氯化钠注射液10 mL冲洗泪道及结膜囊,预防感染。
1.2.4 房水样本采集
所有患者在每次玻璃体注药术前采集房水,采集过程在手术室无菌条件下进行,患者仰卧位,盐酸丙美卡因滴眼液滴眼连续3次,间隔5 min行局部麻醉;碘伏消毒眼周皮肤、 眼脸,常规铺巾,贴一次性薄膜,置开脸器,50 g·L-1聚维酮碘浸泡结膜囊,9 g·L-1氯化钠注射液冲洗结膜囊。采用胰岛素注射器由角膜缘内 1.0 mm小心穿刺入前房,避免触及晶状体、虹膜、角膜内皮,抽取0.1 mL房水,并移至无菌管后立即存放在-80℃冰箱内保存备用;常规行玻璃体注药术,术后涂妥布霉素地塞米松眼膏,无菌纱布包封术眼。
1.2.5 Luminex法检测房水及玻璃体内各细胞因子质量水平
采用Luminex液相芯片检测房水中血管内皮生长因子A(VEGF-A)、PLGF、IL-1β、IL-23、IL-17A和TNF-α等细胞因子的表达水平。试剂盒及配套试剂均采购自北京智德检验所有限公司,所有步骤均严格根据说明书进行操作。样品与标准品经Luminex检测后,获得的荧光值由软件自动计算与优化,形成Excel格式的输出文件,将每例样品检测的原始荧光值代人标准曲线公式,计算获得样品浓度。
1.3 统计学处理
采用SPSS 26.0与GraphPad Prism统计学软件进行统计分析及作图。计数资料使用例(%)表示,采用χ2检验,计量资料均接受正态性检验,服从正态分布使用(x?±s)表示,采用独立样本t检验;偏态分布使用M(Q1,Q3)表示,采用非参数Wilcoxon秩和检验;各细胞因子相关性分析用Spearman秩相关分析。检验水准:α=0.05。
2 结果 
2.1 DME组患者房水细胞因子变化
DME组患者注射治疗前及第1次、第2次注射治疗后比较,房水中VEGF-A、PLGF及IL-23浓度均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05),此外,患者CMT值降低,BCVA提高,差异均有统计学意义(均为P<0.05),其他指标比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表1、表2)。



2.2 PDR组患者注射治疗前后房水细胞因子变化
PDR组患者注射治疗后,房水中VEGF、PLGF、IL-1β、IL-23、IL-17A和TNF-α浓度均较注射治疗前显著降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表3)。


2.3 DME组与PDR组患者注射治疗前房水细胞因子水平比较
DME组患者注射治疗前房水中VEGF-A、PLGF及IL-23水平均高于PDR组患者,差异均有统计学意义(均为P<0.05),除糖化血红蛋白水平外,两组患者间其他指标比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)(表4)。
2.4 DME组患者注射治疗前房水细胞因子、BCVA及CMT之间的相关性分析
Spearman秩相关分析结果显示,注射治疗前,DME组患者中,VEGF与BCVA呈显著负相关(r=-0.767,P=0.004),VEGF与CMT呈显著正相关(r=0.662,P=0.019),VEGF与IL-23呈显著正相关(r=0.765,P=0.004)(表5、图1)。








2.5 PDR患者注射治疗前各房水细胞因子之间的相关性分析
Spearman秩相关分析结果显示, PDR组患者注射治疗前各房水细胞因子之间均无相关性(均为P>0.05)(表6)。





3 讨论
DR作为一种多因素综合原因引起的疾病,其发病的不同阶段以及不同预后一定程度上可以通过眼内的各相关因子的含量表现出来。房水作为眼内的循环液体主要由无色素上皮细胞分泌生成,每分钟大约循环总量的1%,对于大多数细胞因子,房水中的因子水平可以很好地反映出玻璃体内该因子的水平,但也有部分例外[5]。使用眼内液检测来指导DR的治疗、预后是一种很好的辅助手段。
健康人眼内的VEGF具有维持脉络膜毛细血管层、血管床和光感受器平衡的作用,并且对视网膜神经具有神经营养因子的作用。但在DR患者中过多表达的VEGF参与诱发血管生成反应,并且有增加血管通透性和诱发血管渗漏的能力。眼内VEGF含量与DR患者的疾病严重程度、血糖、血脂等指标均呈正相关[6-7]。VEGF-A被认为是DR进展的核心参与者[8]。VEGF-A也成为DR治疗的主要靶点。本研究结果显示,经抗VEGF治疗后,两组患者房水中VEGF含量均明显下降,DME组患者VEGF与BCVA及CMT均有相关性。
PLGF作为VEGF家族中的成员,它是一种促血管生成的因子,可作为 VEGFR-1的特异性配体来调节炎症反应,通过刺激组织因子产生和增强单核细胞/巨噬细胞的趋化性[9]。PLGF在促进新生血管成熟、增加血管通透性以及增强免疫炎症反应过程中发挥重要作用[10]。在与VEGFR-1结合后,PLGF也可以通过钙调神经磷酸酶依赖性途径来增加单核细胞的表达从而产生促炎因子[11],这表明它可能对炎症反应有直接影响。阿柏西普通过与PLGF两侧的紧密结合,可阻止它与其他分子相互作用,进而控制眼内的炎症发展。因此在我们预期的结果中,DR患者经阿柏西普治疗后,炎症相关因子浓度会发生一定程度的下降,但本研究发现,在抗VEGF药物治疗后,除IL-23水平有显著下降外,其他2种炎症因子改变差异无统计学意义。这表明阿柏西普对炎症介质影响有限。本研究结果显示,抗VEGF药物治疗后,两组患者房水中PLGF含量均明显下降,但其下降幅度与BCVA的提高及CMT下降幅度无明显相关性。这说明PLGF在DME中的确切作用以及其特异性抑制对DR患者是否存在收益有待进一步研究。
DR被认为是一种微炎症疾病。炎症贯穿于DR发病的整个过程,表现为全身及眼局部炎症生物标志物增加[2]。IL-23作为一种近年来才被大家给予更多关注的促炎性细胞因子,在炎症性疾病的起病以及病情进展过程中起着不可小觑的作用。有研究证实,IL-23与一种新的淋巴细胞亚群-辅助性T细胞17(Th17)的增殖和维持有密切关系[12]。Th17 细胞亚群已被发现其可以分泌IL-17A、IL-17F、IL-6、IL-21、IL22、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子及TNF-a等多种细胞因子[13],在慢性炎症反应和自身免疫性疾病的起病及进展过程中扮演着不可或缺的角色[14],人体内的T淋巴细胞、自然杀伤细胞等均能表达IL-23受体,当IL-23 与其受体相结合后,通过JAK-STST等信号途径,促使相关细胞因子的分泌,可在炎症性疾病中发挥进一步的作用[12]。有研究证实,IL-23在眼、大脑、关节、肠道、皮肤及肝脏等多个身体器官的炎症性疾病的发生以及病情的发展中起重要作用[15-18]。也有研究报道IL-23在眼部新生血管疾病、肿瘤以及自身免疫性疾病中具有重要作用[19]。有研究表明DME患者血清IL-23水平升高[20],也有研究表明PDR患者玻璃体中IL-23水平升高[12]。本研究显示,DME及PDR患者注药治疗后,房水中IL-23的表达均下降,在DME组患者中,治疗前房水中的VEGF-A与IL-23呈正相关,这表明房水中IL-23的高表达可能协同促进DR的发生发展,可能通过加重糖尿病患者的视网膜炎症反应从而参与DR的病理过程。
本研究在研究PDR患者注药前后细胞因子水平时发现,除VEGF-A、PLGF、IL-23外,IL-1β、IL-17A和TNF-α浓度也有显著降低。以往报道中,IL-1β,IL-17和TNF-α也是重要的致炎因子[21-22]。IL-1β是一种在眼内可由内皮细胞和Müller细胞产生的促炎因子,是视网膜神经炎症的起始以及炎症反应接连放大的主要参与者[23]。IL-17在招募和激活免疫细胞中起重要作用,并通过非免疫细胞,如纤维母细胞、内皮细胞和上皮细胞诱导产生促炎细胞因子[24]。部分研究指出,IL-17 参与糖尿病大血管病变炎症的反应过程,在糖尿病大血管病变发生发展中发挥重要作用,是糖尿病大血管病变的独立危险因素[25]。TNF-α是一种非糖基化蛋白,可促进淋巴细胞增生与趋化,并活化中性粒细胞和单核细胞释放炎性介质以及能促进白细胞对内皮细胞的不可逆转的黏附,增加活性氧的产生,诱发炎症反应,并参与血视网膜屏障的破坏[7,26]。TNF-α在糖尿病患者中的表达率达87%,并与糖尿病的疾病进程及视网膜病变的严重程度相关[27]
本研究发现,DME患者房水中VEGF、PLGF及IL-23水平均明显高于PDR患者。以往研究通常将DR患者分为非增殖期糖尿病性视网膜病变和PDR,将DME患者分为轻度、中度及重度DME。DME及PDR分别处于DR发病的不同阶段,本研究通过检测不同阶段房水中相关细胞因子的浓度及其治疗前后的变化,探讨房水中相关细胞因子与DR患者疾病进展的相关性,更好的指导临床治疗方案的选择。DME患者因其更高的VEGF、PLGF及IL-23表达水平,可能需要更多的抗VEGF次数注药治疗,有望通过检测房水中VEGF、PLGF及IL-23表达水平,更好的为患者制定个性化抗VEGF治疗方案。另外,有研究表明,PDR患者房水中VEGF水平与健康对照组比较,差异无统计学意义,但其玻璃体中VEGF含量明显增高,与健康对照组比较,差异有统计学意义[28]。推测在严重的PDR患者眼中,缺血缺氧的视网膜异常释放的大量VEGF最早出现在玻璃体中,再向眼前节扩散,导致房水中VEGF浓度低于玻璃体。本试验仅对比了两组患者房水中VEGF浓度,并未比较玻璃体中的VEGF浓度,今后将对此做进一步研究。
4 结论
VEGF、PLGF及IL-23水平变化与DME及PDR的发生发展有密切关系。抗VEGF治疗可使DME组患者CMT 变薄,黄斑区水肿减轻,视力得到改善。房水中IL-23的表达水平可作为DR患者抗VEGF疗效的预测因子,为DR的早诊断、早治疗提供新的靶点。