《眼科新进展》  2024年6期 443-448   出版日期:2024-06-03   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
DRP1调控线粒体稳态对人视网膜色素上皮细胞上皮-间充质转化的影响


年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种神经退行性疾病,主要由视网膜色素上皮(RPE)细胞的进行性退化引起[1]。视网膜下纤维化是AMD的终末期,能够导致永久性的视力丧失。纤维化是一种异常和过度的伤口愈合反应的产物,其特征是存在运动和收缩的间充质细胞,而上皮细胞转化为间充质细胞的过程为上皮-间充质转化(EMT)。在AMD中,RPE细胞失去了细胞间的黏附性和顶端-基底端的极性,通过EMT转化为间充质细胞,并在视网膜下纤维化的发病机制中起关键作用[2]。RPE的EMT过程不仅存在于AMD的视网膜下纤维化,还存在于增生性玻璃体视网膜病变、视网膜前膜及增生型糖尿病视网膜病变的视网膜纤维化中[3]。因此,抑制RPE细胞EMT的进程是治疗AMD的潜在靶点。线粒体作为细胞能量工厂,调控众多疾病进展,如AMD、糖尿病性视网膜病变、高血压等[4-6]。线粒体融合与分裂的动态平衡维持着线粒体正常功能的运行。线粒体动力相关蛋白(DRP1)作为促进线粒体分裂的关键蛋白,能够调控线粒体稳态。近年来,线粒体稳态在AMD发生发展中的作用引起了研究人员的关注[7-8]。研究表明,改善线粒体功能可以提高细胞抗氧化能力,抑制RPE变性,改善AMD的病理进程[9]。此外,EMT的进程与线粒体功能紧密联系,当线粒体稳态失衡时,会促进EMT的进展[10-11]。但DRP1是否能调控AMD病理生理过程中EMT的进展目前尚不十分清楚。因此,本研究采用H2O2诱导的ARPE-19细胞损伤模型,从抗纤维化角度研究DRP1对ARPE-19细胞EMT进展的抑制作用,进一步探讨其防治AMD的作用机制。
1 材料与方法 
1.1 主要试剂
胎牛血清、胰蛋白酶购自Sigma公司(美国密苏里州),DRP-1抗体、E-钙黏蛋白抗体、N-钙黏蛋白抗体、紧密连接蛋白(ZO-1)抗体、β-actin抗体购自Proteintech公司(中国上海),p-DRP-1抗体、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)抗体、波型蛋白(Vimintin)阳性抗体购自CST公司(美国马塞诸塞州),DMEM/F12培养液购自Gibco公司(美国纽约),Mdivi-1(线粒体分裂抑制剂,能够改善线粒体动力学,维持线粒体稳态)购自MCE公司(美国新泽西),线粒体超氧化物红色荧光探针购自上海翌圣生物科技股份有限公司,RIPA裂解液、线粒体红色荧光探针、线粒体膜电位检测JC-1染色试剂盒、牛血清白蛋白(BSA)、抗荧光淬灭封片液(含DAPI)、青霉素-链霉素溶液购自碧云天生物有限公司,5×SDS上样缓冲液购自上海生工生物工程有限公司,PVDF膜购自北京利科生化科贸有限公司。
1.2 方法 
1.2.1 ARPE-19细胞培养
ARPE-19细胞购自中国典型培养物保存中心。细胞接种于培养瓶中,加入含体积分数10%胎牛血清和10 g·L-1青霉素-链霉素的DMEM/F12培养液,并置于体积分数5%CO2及37 ℃培养箱内培养,根据细胞生长速度及状态,给予换液或传代。
1.2.2 实验分组与处理
待ARPE-19细胞贴壁培养24 h后,将细胞分为3组进行研究,NG组:采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养ARPE-19细胞6 h;H2O2组:采用650 μmol·L-1 H2O2刺激细胞,并于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养ARPE-19细胞6 h;H2O2+Mdivi-1组:采用10 μmol·L-1 Mdivi-1处理ARPE-19细胞2 h后,给予650 μmol·L-1 H2O2刺激,再于含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养基继续培养ARPE-19细胞6 h。待分组细胞处理完成后,进行后续实验。
1.2.3 Western blot检测p-DRP-1/DRP1蛋白表达
待细胞处理完成后,收取贴壁细胞蛋白,并根据目的蛋白分子量的大小,配置不同浓度的凝胶。自一侧加入5 μL蛋白质电泳分子量标准(Marker),并按顺序在各泳道按顺序加入不同组别的蛋白,随后以80 V电压进行电泳,待Marker红色标记线出现,再将电压加大至150 V电泳,直至下端Marker标记线达到合适位置后进行转膜。待转膜结束后,PVDF膜置于50 g·L-1脱脂奶粉室温封闭2 h,TBS摇床清洗3次,一抗孵育过夜。第2天室温孵育二抗2 h,TBS清洗3次,通过显影液进行显影后,使用ImageJ软件对蛋白条带灰度值进行统计分析。
1.2.4 线粒体形态学检测
通过线粒体红色荧光探针检测线粒体形态,待细胞处理完成后,ARPE-19细胞在线粒体红色荧光探针染色液中孵育30 min,随后通过荧光显微镜下观察线粒体形态学。
1.2.5 线粒体超氧化物红色荧光探针染色
通过线粒体超氧化物红色荧光探针检测线粒体活性氧(ROS)水平,待细胞处理完成后,ARPE-19细胞在线粒体超氧化物红色荧光探针染色液中孵育30 min,吸弃染色剂,PBS清洗3次,随后荧光显微镜下观察线粒体ROS的表达。
1.2.6 JC-1染色
通过JC-1染色试剂盒检测线粒体膜电位。ARPE-19细胞与JC-1染液孵育30 min,随后吸弃染色液,试剂盒内1×缓冲液清洗3次,随后荧光显微镜下观察细胞检测线粒体膜电位的变化,最后通过ImageJ软件分析细胞红/绿荧光强度的比值,以此量化细胞去极化程度。
1.2.7 免疫荧光染色
ARPE-19细胞给药刺激结束后,在40 g·L-1多聚甲醛固定10 min,PBS清洗3次后通过4 g·L-1 Tritunx-100破膜10 min,随后在5 g·L-1 BSA室温封闭2 h。封闭结束后,一抗孵育过夜,第2天避光孵育荧光二抗2 h,PBS清洗后,加入含DAPI的抗荧光淬灭剂封片,随后在荧光显微镜下进行拍照观察。
1.3 统计学处理
使用SPSS 22.0软件系统进行统计学分析,实验数据以x?±s表示,两组间比较采用独立样本t检验。检验水准:α=0.05。
2 结果 
2.1 各组细胞中p-DRP-1/DRP1蛋白表达水平及线粒体碎片化变化
线粒体动力学主要包括线粒体融合与分裂,两者动态平衡的破坏会损伤线粒体稳态,促使细胞死亡,而p-DRP-1/DRP1蛋白的比值为线粒体分裂水平的体现。实验结果显示,H2O2组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值(4.98±0.43)高于NG组(1.00±0.22),差异有统计学意义(P<0.05);H2O2+Mdivi-1组细胞p-DRP-1/DRP1蛋白表达比值(1.62±0.13)低于H2O2组,差异有统计学意义(P<0.05)(图1)。H2O2处理的细胞由于诱导线粒体损伤而出现线粒体碎片化,而在Mdivi-1药物干预后,线粒体碎片化程度得到改善(图2)。






2.2 各组细胞线粒体ROS水平
正常细胞ROS的形成与消除处于动态平衡,线粒体是生成ROS的主要场所,当ROS生成过度时,会诱发细胞氧化应激,造成细胞损伤。荧光探针染色结果显示,NG组细胞线粒体ROS水平为1.00±0.17,H2O2组细胞线粒体ROS水平(4.42±0.29)增高,而H2O2+Mdivi-1组细胞线粒体ROS的表达水平(2.15±0.18)有所降低,Mdivi-1改善了线粒体功能,NG组细胞线粒体ROS水平与H2O2组比较,H2O2+Mdivi-1组细胞线粒体ROS水平与H2O2组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图3)。


2.3 各组细胞线粒体膜电位变化
JC-1染色是测定线粒体膜电位的经典方法,线粒体膜电位的下降是细胞凋亡的早期标志。实验结果表明,H2O2组细胞红/绿荧光强度比值下降,线粒体发生了去极化,膜电位下降,促使线粒体功能紊乱,而Mdivi-1逆转了H2O2诱导的线粒体膜电位下降(图4)。NG组、H2O2组及H2O2+Mdivi-1组细胞红/绿荧光强度比值分别为1.00±0.09、0.16±0.12、0.42±0.05,NG组细胞红/绿荧光强度比值与H2O2组比较,H2O2+Mdivi-1组细胞红/绿荧光强度比值与H2O2组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。


2.4 各组细胞EMT进展变化
线粒体功能紊乱与EMT进展密切相关,EMT相关上皮样标志物主要包括:E-钙黏蛋白、ZO-1,而间质样标志物主要包括:α-SMA、N-钙黏蛋白和Vimintin。实验结果表明,NC组细胞α-SMA、N-钙黏蛋白和Vimintin相对表达量分别为1.00±0.08、1.00±0.08、1.00±0.09,E-钙黏蛋白与ZO-1相对表达量分别为1.00±0.09与1.00±0.06;H2O2组细胞α-SMA、N-钙黏蛋白和Vimintin相对表达量分别为2.11±0.13、4.11±0.30、4.54±0.23,E-钙黏蛋白与ZO-1相对表达量分别为0.40±0.02与0.61±0.05;H2O2+Mdivi-1组细胞α-SMA、N-钙黏蛋白和Vimintin相对表达量分别为1.15±0.13、1.71±0.11、1.70±0.20,E-钙黏蛋白与ZO-1相对表达量分别为0.80±0.04与0.91±0.06。H2O2组细胞上皮样标志物表达下降,而间质样标志物表达上升,H2O2促进了细胞的EMT进展。Mdivi-1干预后,上皮样标志物表达上升,而间质样标志物表达下降,细胞EMT进展得到了逆转。各组细胞α-SMA、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、Vimintin及ZO-1相对表达量比较,NG组与H2O2组比较,H2O2+Mdivi-1组与H2O2组比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图5、图6)。ZO-1免疫荧光染色实验显示,H2O2+Mdivi-1组的细胞连接紧密程度优于H2O2组,Mdivi-1能够逆转H2O2诱导的细胞紧密连接的损伤(图7)。









3 讨论
AMD是一种进行性眼病,大多数患者视力丧失发生在疾病的晚期,而视网膜下纤维化是其重要原因之一。尽管AMD的治疗目前取得了一定进展,但其仍然是一个重要的公共卫生问题[12]。RPE细胞退化而转化为间充质细胞是EMT的关键,其介导的视网膜下纤维化被认为是AMD进展的重要原因[13]。目前AMD的病因尚不清楚,但该疾病受到各种因素影响,包括慢性低度炎症、系统免疫失衡以及局部眼部因素,而RPE细胞功能障碍是主要原因之一[14]。因此,靶向RPE细胞EMT进程是逆转AMD病理进展的新策略。H2O2刺激RPE细胞是体外模拟AMD进展的经典造模方法[15]。本研究发现,RPE细胞DRP1的表达在H2O2条件下被显著上调,并伴随着线粒体功能紊乱及EMT进展,提示DRP1在介导RPE细胞损伤相关的AMD进展中发挥重要作用。
线粒体动力学是维持线粒体稳态的关键环节之一,而碎片化和功能失调的线粒体与年龄相关疾病有关(包括AMD)[16]。本研究发现,H2O2处理的RPE细胞中线粒体出现了过度碎片化,表明线粒体与RPE细胞功能之间存在相关性,并可能影响AMD的进展,但目前确切的机制仍不十分清楚。研究表明,线粒体的融合和分裂在不同的应激条件下受到动态调节,过度的应激会导致线粒体网络的破坏,进而导致线粒体过度碎裂和功能障碍,最终导致细胞凋亡[17]。正常情况下,线粒体在细胞质中以管状状态存在,并形成复杂的线粒体网络,且管状线粒体具有较好的线粒体功能,然而,线粒体损伤后,线粒体分裂加速,线粒体变为碎裂状态,而线粒体功能障碍随着线粒体碎片化程度的加重而进展[18]。有研究结果表明,Mdivi-1通过抑制DRP1在线粒体表面的积聚来减少DRP1的激活,进而降低线粒体碎片化程度[19]。同样有研究发现,蓝光能够诱导RPE细胞中线粒体融合与裂变的失衡,促使线粒体断裂并加重RPE细胞变性损伤,最终诱导AMD的病理进展[20]。本研究结果表明,Mdivi-1能够通过减轻线粒体碎片化而改善线粒体稳态,维持RPE细胞的正常生理功能。
EMT是上皮细胞在生理或病理情况下,转化为具有间质表型细胞的生物学过程[13]。RPE细胞的EMT是增生性玻璃体视网膜病变和新生血管性AMD发病机制中的关键事件,是严重视力丧失的主要原因[21]。在新生血管性AMD的疾病模型中,Wnt5a和β-连环蛋白之间的相互激活促使α-SMA、纤连蛋白表达增加,介导视网膜EMT进展[22]。褐藻糖胶是一种海洋提取物,具有抗炎、抗氧化应激和抗癌等功效,其能够通过下调α-SMA与纤连蛋白的表达并上调E-钙黏蛋白的表达,抑制EMT的进展,最终减缓增生性玻璃体视网膜病变的进程[23]。研究发现,miR-29b在ARPE-19细胞EMT的miRNA表达谱中显著下调;抑制miR-29b的表达可上调α-SMA蛋白水平并下调E-钙黏蛋白和ZO-1的蛋白水平,增加细胞迁移,触发EMT过程[24]。本研究结果表明,Mdivi-1预处理后能够下调α-SMA、N-钙黏蛋白和Vimintin的表达,并上调E-钙黏蛋白、ZO-1表达,抑制RPE细胞的EMT进展。
线粒体是细胞内ROS主要来源,线粒体产生的ROS可引起线粒体功能紊乱,促进疾病进展。研究表明,线粒体功能障碍在诱导细胞 EMT 的进程发挥重要作用[25]。沉默调节蛋白3作为一种重要的保护性介质,可抑制线粒体ROS生产过度,改善线粒体形态及线粒体膜电位,逆转EMT进展并缓解肾小管纤维化的进程[26]。在线粒体功能障碍期间,线粒体膜电位的下降通常与ROS的过度产生密切相关。线粒体膜电位的下降作为细胞凋亡的早期标志,通过恢复线粒体膜电位能够改善细胞的氧化应激损伤及凋亡水平[27]。Zou等[28]研究发现,乳酸能够通过减轻H2O2诱导的线粒体膜电位下降和细胞内ROS 的产生阻止H2O2诱导的线粒体分裂并维持线粒体功能,最终改善视网膜变性。在高糖诱导的子宫内膜癌中,DRP1过度激活可引起线粒体功能障碍,促进EMT的进展,加速肿瘤的迁移和侵袭,相反,敲减DRP1后能够缓解上述改变[29],而本研究结果同样发现,Mdivi-1改善线粒体稳态后,能够降低细胞内ROS水平,改善线粒体膜电位,抑制EMT进展。
AMD的主要病理发生在RPE细胞水平,Ghosh等[30]发现,干性AMD患者RPE细胞中EMT转录标志物Vimintin和Snail1表达上调,而E-钙黏蛋白的表达下调,这表明干性AMD患者RPE细胞发生了EMT进展。孤儿核受体相关1作为参与 AMD 发生发展的关键转录因子,其激活和过表达能够通过逆转RPE 细胞的EMT进展,抑制免疫细胞聚集,减少脂质积累,进而改善湿性及干性 AMD小鼠的视网膜功能[31]。因此,Mdivi-1干预后能够通过改善RPE细胞的线粒体功能逆转EMT的进程,进而抑制AMD的进展,保护视网膜功能。
本研究结果有助于理解H2O2诱导的RPE细胞损伤机制,为将DRP1作为AMD的治疗靶点提供了实验依据。然而,本研究仅在体外探讨了RPE细胞DRP1的变化在AMD中的可能作用,DRP1如何参与AMD的发生发展的分子机制还需要进一步研究,并利用动物模型及临床标本加以验证。
4 结论
H2O2可诱导RPE细胞模型中的DRP1磷酸化蛋白的表达上调,导致线粒体碎片化加重,线粒体功能紊乱。DRP1可调控线粒体动态平衡,靶向DRP1可改善线粒体功能并抑制EMT进展,从而减轻H2O2诱导的RPE细胞功能障碍。