《眼科新进展》  2024年6期 438-442   出版日期:2024-06-03   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
汉黄芩素对青光眼小鼠视网膜神经节细胞的保护作用及其机制研究


青光眼是全球首位不可逆的致盲疾病,也是导致视力丧失的第二大原因,据统计资料显示,全球范围内约有7 960万人因青光眼导致视力丧失[1]。青光眼致病原因、发生机制较多,如眼压升高、视神经血流减少、氧化应激及炎性损伤等[2]。也有学者认为,视网膜神经节细胞(RGC)数目减少和进行性丢失是导致青光眼致盲的主要原因[3]。汉黄芩素是中药黄芩主要活性成分之一,是从黄芩根中分离出来的一种天然黄酮类化合物,具有促进胰岛素分泌、降血糖、抗炎、抗氧化、保护神经、保护血管、抗肿瘤、抗血栓等药理作用[4]。有研究认为,汉黄芩素可改善2型糖尿病视网膜病变小鼠氧化应激损伤[5],还可以抑制幼鼠视网膜组织血管形成[6]。但汉黄芩素对青光眼小鼠模型的实验研究鲜有报道。核苷酸寡聚化结构域样受体家族3(NLRP3)炎性小体是炎性免疫应答过程的重要组成部分,有研究发现,NLRP3炎性小体过度激活可参与糖尿病、眼科疾病等发病过程[7]。基于此,本研究探究汉黄芩素对青光眼小鼠RGC的保护作用及相关作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物

10只C57BL/6J雌性小鼠,10月龄,购自中国中医科学院眼科医院;40只DBA/2J雌性小鼠,10月龄,购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养条件:明暗光照时间各12 h,自由饮食和进水,温度(22±2)℃。本研究经沧州市中心医院伦理委员会审查批准(批号:CY202301235)。
1.2 主要试剂与仪器
汉黄芩素(纯度:98%)购于上海钰博生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒均购于上海酶研生物科技有限公司;一氧化氮合酶(NOS)试剂盒购于上海一研生物科技有限公司;白细胞介素(IL)-6试剂盒、IL-1β试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒均购于上海继和生物科技有限公司;NLRP3抗体、半胱天冬酶-1(Caspase-1)抗体、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)抗体、GAPDH抗体均购于英国Abcam公司;化学发光试剂、二喹啉甲酸(BCA)均购于北京索莱宝公司。BX53P显微镜购于日本奥林巴斯。
1.3 方法
1.3.1 建立模型

DBA/2J建模方法:DBA/2J 小鼠随着衰老逐渐出现进展性眼部异常,与人类遗传性青光眼非常相似。眼部异常包括虹膜色素分散、虹膜萎缩、虹膜前粘连(虹膜与角膜粘连)和眼压升高。DBA/2J小鼠从3~4个月龄开始出现疾病症状,56%雌鼠和15%雄鼠在此时出现虹膜色素上皮细胞色素丢失和周边虹膜透光的表现。到6~7月龄时,所有小鼠都表现出明显的广泛透光和虹膜边界增厚,部分雌鼠在6月龄时眼压明显升高。到9月龄时,所有小鼠均表现出眼压升高,故本研究选择10月龄小鼠进行实验。动态观察40只DBA/2J小鼠眼压、眼前节变化,38周龄时小鼠眼压异常升高,裂隙灯下观察到小鼠虹膜色素消失、角膜钙化斑、瞳孔移位及部分并发白内障[8],视为造模成功。
1.3.2 动物分组和给药
造模成功后,将40只DBA/2J小鼠分为模型组和实验1、2、3组,每组各10只,10只C57BL/6J小鼠作为对照组,所有小鼠均选择右眼为实验眼。小鼠造模成功后,对照组、模型组小鼠灌胃生理盐水3 mL,实验1、2、3组小鼠分别灌胃50、100、150 mg·kg-1汉黄芩素,每天灌胃1次,连续灌胃2个月。
1.3.3 眼压测量
各组小鼠每天同一时间段(2∶00 pm~5∶00 pm),使用Tonopen AVIA接触式眼压笔检测各组小鼠眼压。统计灌胃前(造模成功)、灌胃2周、灌胃4周、灌胃8周各组小鼠眼压变化。
1.3.4 RGC数量及视网膜厚度检测
给药8周后,各组小鼠腹腔注射40 mg·kg-1戊巴比妥钠后颈椎脱臼法处死,摘取入选眼50只(50眼),显微镜下剥离视网膜组织,置-20 ℃冰箱保存。取各组小鼠视网膜组织1 mg用于制作切片,用多聚甲醛固定、脱水、包埋切片,采用苏木素染色,5~10 min后冲洗,用乙醇分化,浸泡15 min后伊红复染,乙醇再次脱水,二甲苯Ⅰ、Ⅱ浸泡,中性树脂封片。倒置显微镜(20倍物镜)下观察小鼠RGC数量;从视盘处开始,取两侧明亮视野,用ImageJ分析小鼠视网膜厚度。
1.3.5 比色法检测氧化应激指标
取各组小鼠视网膜组织1 mg,用生理盐水冲洗干净,剪碎后在研钵内充分研磨用于制备匀浆液,3 500 r·min-1离心10 min,采用比色法检测各组小鼠SOD、GSH-Px、NOS水平,操作步骤严格按照试剂盒说明进行。
1.3.6 酶联免疫吸附法检测小鼠视网膜炎性因子
取各组小鼠视网膜组织1 mg,剪碎后在研钵内充分研磨用于制备匀浆液,3 500 r·min-1离心10 min,采用酶联免疫吸附法检测各组小鼠视网膜 IL-6、IL-1β、TNF-α表达,操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。
1.3.7 Western blot检测小鼠视网膜NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达
采用Western blot检测各组小鼠视网膜NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达。取各组小鼠视网膜组织1 mg,添加裂解液用于提取组织总蛋白,按照BCA法检测定量蛋白浓度,行SDS-PAGE凝胶电泳后,将蛋白转移至PVDF膜上,用5 g·L-1脱脂奶粉封闭培养,充分洗膜后加一抗NLRP3、Caspase-1、ASC、GAPDH稀释液,4℃孵育过夜,第2天加Goat Anti-Rabbit IgG二抗稀释液常温孵育,用化学发光试剂显色、曝光。GAPDH作为内参,用ImageJ分析蛋白灰度值。
1.4 统计学分析
采用SPSS 25.0软件分析数据,结果以x?±s表示,多组间比较采用单因素方差分析,事后两两比较采用LSD-t检验。检验水准:α=0.05。
2 结果 
2.1 各组小鼠眼压比较
灌胃前:5组小鼠眼压比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠眼压均升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05);但其余4组眼压两两比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。灌胃2周、4周、8周:5组小鼠眼压比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠眼压均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验1、2、3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验1组相比,实验2、3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠眼压均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表1)。
2.2 各组小鼠RGC数量及视网膜厚度比较
5组小鼠RGC数量及视网膜厚度比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表2)。与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验1、2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验1组相比,实验2、3组小鼠RGC数量及视网膜厚度均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠RGC数量及视网膜厚度均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。







2.3 各组小鼠视网膜组织氧化应激指标比较
5组小鼠视网膜SOD、GSH-Px、NOS水平比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表3)。与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠视网膜SOD、GSH-Px水平均降低,NOS水平增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验1、2、3组小鼠视网膜SOD、GSH-Px水平均增加,NOS水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验1组相比,实验2、3组小鼠视网膜SOD、GSH-Px水平均增加,NOS水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠视网膜SOD、GSH-Px水平均增加,NOS水平降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。



2.4 各组小鼠视网膜组织炎性因子比较
5组小鼠视网膜IL-6、IL-1β、TNF-α表达水平比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表4)。与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠视网膜IL-6、IL-1β、TNF-α水平均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验1、2、3组小鼠视网膜IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验1组相比,实验2、3组小鼠视网膜IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠视网膜IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。



2.5 各组小鼠NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达水平比较
5组小鼠视网膜NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(表5)。与对照组相比,模型组和实验1、2、3组小鼠视网膜NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达均增加,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与模型组相比,实验



1、2、3组小鼠视网膜NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验1组相比,实验2、3组小鼠视网膜NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05);与实验2组相比,实验3组小鼠视网膜NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图1)。



3 讨论
青光眼主要病理基础为视神经病变,可表现为RGC变性和视神经损伤,最终导致进行性视野丧失[9],也有学者对RGC分子机制进行全面研究,RGC变性和视神经损伤在青光眼治疗中至关重要[10]。DBA/2J小鼠在一定时期内可随着年龄增长,眼压呈上升趋势,进而导致RGC变性,可较好模拟临床青光眼发病特点,更适合表观遗传学机制特征[11]。DBA/2J小鼠在2~3月龄时虹膜眼压、视神经节组织正常,从6月龄开始出现眼压异常升高、虹膜异常,至8~9月龄出现RGC、视神经异常表现,直至第18个月[12]。由于雌性小鼠发病早、疾病进展快,故本研究选择10月龄DBA/2J小鼠进行研究。
本研究结果显示,灌胃2周、4周、8周,相较于对照组,模型组和实验1、2、3组小鼠眼压升高,RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均降低,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均增加,这与既往研究[13-14]观点一致,提示青光眼可诱导RGC数量改变,并促进视网膜组织发生氧化应激和炎症反应,表明模型构建成功。汉黄芩素化学名为5,7-二羟基-8-甲氧基黄酮,是天然黄酮类化合物,药理实验显示,其具有抗病毒、抗菌、抗氧化、保护血管、抗炎、抗肿瘤等多种作用;此外,汉黄芩素还具有降血糖、减轻视网膜病变血管损伤、保护神经等作用[15]。多项研究表明,黄酮类化合物对青光眼鼠模型RGC具有保护作用[16-17]。本研究给予小鼠灌胃不同浓度汉黄芩素后,与模型组相比,实验1、2、3组小鼠灌胃不同时间眼压均降低,RGC数量及视网膜厚度、SOD水平、GSH-Px水平均增加,NOS、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低,表明汉黄芩素对青光眼小鼠RGC有保护作用,并减轻视网膜组织氧化应激和炎性损伤。
炎性小体是多种蛋白复合物,通过募集相关炎性细胞从而诱发炎性级联反应,目前研究发现[18],炎性小体主要包括NLRP1、NLRP3等,随着对NLRP3深入研究,NLRP3通过与Caspase-1、ASC结合形成炎性小体,并进一步诱导IL-6、IL-1β等细胞因子分泌,诱发机体炎症反应。有研究显示[19],抑制NLRP3炎性小体激活可减轻青光眼大鼠视网膜组织炎性损伤,从而发挥保护RGC的作用。本研究结果显示,模型组小鼠视网膜NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达较对照组上调,而汉黄芩素呈剂量依赖性下调NLRP3、Caspase-1、ASC蛋白表达,表明汉黄芩素对青光眼小鼠RGC有保护作用,可能与NLRP3炎性小体有关。
4 结论
汉黄芩素可通过抑制NLRP3炎性小体激活进而降低青光眼小鼠眼压,改善视网膜厚度,减轻视网膜组织氧化损伤和炎症反应,但有关汉黄芩素与NLRP3炎性小体对青光眼的具体作用机制还需要深入研究探讨。