《眼科新进展》  2024年6期 433-437   出版日期:2024-06-03   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
金合欢素调节Sirt1/AMPK/Nrf2信号通路对糖尿病白内障大鼠氧化应激损伤的影响


糖尿病白内障(DC)是糖尿病常见的并发症,表现为视力减退、视物模糊、复视或多视等,DC的发生与高血糖诱发的氧自由基积聚、晶状体损坏和房水中抗氧化系统失调有关,减少氧自由基产生、缓解炎症和晶状体氧化损伤是延缓DC进展的突破口[1-2]。DC发病早、进展快,通常需要手术治疗,然而术后护理和并发症给从业人员带来极大的挑战[3]。金合欢素是一种天然树胶衍生物,研究表明,金合欢素通过激活沉默调节蛋白1(Sirt1)及其调控因子腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号降低细胞内活性氧(ROS)的产生,保护糖尿病患者血管内皮免受损伤[4]。且金合欢素能够改善糖尿病大鼠的血糖水平,通过提高抗氧化能力改善糖尿病大鼠的肝肾损伤[5]。然而,金合欢素对DC的影响还未见有研究。Sirt1脱乙酰化激活核因子E2相关因子2(Nrf2),多种药物已被证明通过激活Nrf2信号起到抗氧化应激和抗炎作用,治疗老年性眼病[6]。有文献显示,激活AMPK/Sirt1/PGC-1α通路有助于减轻DC大鼠的炎症和氧化应激损伤[7]。但金合欢素能否通过调节Sirt1/AMPK/Nrf2信号通路抑制DC大鼠氧化应激损伤暂不明确,本研究旨在探究金合欢素对DC大鼠的影响和对Sirt1/AMPK/Nrf2轴的调控作用,以期为DC的临床治疗提供新思路。
1 材料与方法 
1.1 材料 
1.1.1 实验动物
60只雄性SD大鼠,体重206~235 g,购自华中科技大学动物实验中心[SCXK(鄂)2021-0009]。动物饲养于SPF级动物房,实验操作遵守相关规定。本研究经湖南省永州职业技术学院医学技术学院动物伦理委员会批准(批号:202304003)。
1.1.2 主要试剂与仪器
金合欢素(纯度99.84%,HY-N0451)、链脲佐菌素(纯度99.15%,HY-13753)、Sirt1抑制剂(EX527;HY-15452)购自美国MCE公司;白细胞介素(IL)-1β(CB10205-Ra)、IL-6(CB10218-Ra)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px;CB10394-Ra)、丙二醛(MDA;CB10238-Ra)、超氧化物歧化酶(SOD;CB10258-Ra)ELISA检测试剂盒购自上海科艾博生物技术有限公司;一抗Sirt1(ab110304)、AMPK(ab32047)购自美国Abcam公司;一抗Nrf2(80593-1-RR)购自武汉三鹰生物技术有限公司。NICAP-T20A无创血压系统购自脉联(重庆)医疗科技有限公司。
1.2 方法 
1.2.1 动物造模及给药
建立DC大鼠模型[8]:使用柠檬酸缓冲液配制10 g·L-1的链脲佐菌素溶液并以60 mg·kg-1剂量腹腔注射,72 h后尾静脉取血测定空腹血糖(FBG),选取FBG≥16.7 mmol·L-1的大鼠继续饲养6周,裂隙灯下观察晶状体,晶状体出现空泡且有乳白色絮状混浊提示DC大鼠模型构建成功。
将所有大鼠依据随机数字表法分为5组:对照组、模型组、金合欢素低剂量组、金合欢素高剂量组、金合欢素+EX527组,每组12只。除对照组以外的大鼠均构建DC模型,对照组大鼠仅腹腔注射等量的生理盐水。造模成功后第2天,金合欢素低、高剂量组大鼠分别经颈部皮下注射10 mg·kg-1、20 mg·kg-1的金合欢素,每天2次[9],同时经皮下埋入渗透微型泵,每天泵入3.5 mg·kg-1生理盐水;金合欢素+EX527组大鼠经颈部皮下注射20 mg·kg-1金合欢素,每天2次,同时经皮下埋入渗透微型泵,每天泵入3.5 mg·kg-1 EX527[10];对照组和模型组大鼠颈部皮下注射+皮下埋入渗透微型泵,每天给予等量生理盐水。给药持续4周。
1.2.2 血压及FBG测量
给药结束第2 天,所有大鼠固定于固定器中,无创血压系统测量大鼠收缩压,连续读取6次数据,去掉最大值和最小值,取平均值。24 h后,采集尾静脉血,使用血糖仪检测FBG。
1.2.3 晶状体混浊状况评价
吸入乙醚法麻醉所有大鼠,裂隙灯照射法观察大鼠晶状体混浊状况,评分标准[11]:1分,晶状体清透明亮;2分,晶状体周围可见少量空泡,轻度混浊;3分,晶状体周围空泡扩散至中心,核区有雾状混浊;4分,空泡扩散至核区,核区混浊加重;5分,晶状体核区混浊,即完全性白内障。
1.2.4 晶状体组织病理学观察
1.2.3结束后,每组随机选择6只大鼠,吸入乙醚法麻醉后,腹主动脉采血,离心,吸出上层血清,分装后-80 ℃保存。采血后处死大鼠,取眼球,剥离出晶状体,浸入40 g·L-1多聚甲醛中,制作石蜡切片,HE染色法观察晶状体组织病理变化。
1.2.5 血清氧化应激因子和炎症因子含量检测
取1.2.4血清样本,按照ELISA试剂盒说明书,将待测样品和不同浓度标准品加入12孔板中,每孔100 μL,接着加入相应的酶标抗体工作液,每孔50 μL。用封板胶纸封住反应孔,室温孵育3 h。洗板,每孔加100 μL显色剂,室温避光孵育20 min,加终止液100 μL,混匀后即刻检测450 nm光密度值,并根据标准曲线计算氧化应激因子MDA、SOD、GSH-Px和炎症因子IL-6、IL-1β的含量。
1.2.6 晶状体Sirt1、p-AMPK、AMPK、Nrf2蛋白表达水平检测
麻醉并处死每组剩余6只大鼠,剥离出晶状体,匀浆,蛋白浓度定量,Western blot法检测Sirt1、p-AMPK、AMPK、Nrf2蛋白的表达水平:样品上样,通过电泳、切胶、转膜将样品转至PVDF膜,封闭,经一抗(1∶1 000)、二抗(1∶5 000)稀释液孵育目的条带后,滴加ECL发光液,拍照并分析蛋白表达水平,以GAPDH为内参。
1.3 统计学分析
使用GraphPad Prism 8.0.2软件分析,所有数据符合正态分布并以均数±标准差表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用SNK-q检验。检验水准:α=0.05。
2 结果 
2.1 各组大鼠收缩压与FBG比较
与对照组比较,模型组大鼠收缩压和FBG均升高(均为P<0.05);与模型组比较,金合欢素低、高剂量组大鼠收缩压和FBG均降低(均为P<0.05);与金合欢素低剂量组比较,金合欢素高剂量组大鼠收缩压和FBG均降低(均为P<0.05);与金合欢素高剂量组比较,金合欢素+EX527组大鼠收缩压和FBG均升高(均为P<0.05)(表1)。



2.2 各组大鼠晶状体混浊状况比较
给药结束第2 天,对照组、模型组、金合欢素低剂量组、金合欢素高剂量组、金合欢素+EX527组大鼠晶状体混浊评分分别为(0.00±0.00)分、(3.95±0.42)分、(2.83±0.26)分、(1.60±0.13)分、(3.42±0.37)分,5组间比较差异有统计学意义(F=377.821,P<0.001)。进一步两两比较结果显示,与对照组比较,模型组大鼠晶状体混浊评分升高(P<0.05);与模型组比较,金合欢素低、高剂量组大鼠晶状体混浊评分均降低(均为P<0.05);与金合欢素低剂量组比较,金合欢素高剂量组大鼠晶状体混浊评分降低(P<0.05);与金合欢素高剂量组比较,金合欢素+EX527组大鼠晶状体混浊评分升高(P<0.05)。
2.3 各组大鼠晶状体组织病理学变化
对照组大鼠晶状体上皮细胞均匀分布于前囊和赤道部;模型组大鼠可见片状、条索状晶状体上皮细胞向晶状体成纤维细胞迁移性聚集的现象;金合欢素低、高剂量组较模型组大鼠晶状体上皮细胞迁移性聚集现象改善,异常形态细胞数减少;与金合欢素高剂量组比较,金合欢素+EX527组大鼠晶状体上皮细胞形态改变和聚集现象加重(图1)。


2.4 各组大鼠血清氧化应激因子含量比较
与对照组比较,模型组大鼠血清MDA含量升高,SOD、GSH-Px含量均降低(均为P<0.05);与模型组比较,金合欢素低、高剂量组大鼠血清MDA含量均降低,SOD、GSH-Px含量均升高(均为P<0.05);与金合欢素低剂量组比较,金合欢素高剂量组大鼠血清MDA含量降低,SOD、GSH-Px含量均升高(均为P<0.05);与金合欢素高剂量组比较,金合欢素+EX527组大鼠血清MDA含量升高,SOD、GSH-Px含量均降低(均为P<0.05)(表2)。



2.5 各组大鼠血清炎症因子含量比较
与对照组比较,模型组大鼠血清IL-6、IL-1β含量均升高(均为P<0.05);与模型组比较,金合欢素低、高剂量组IL-6、IL-1β含量均降低(均为P<0.05);与金合欢素低剂量组比较,金合欢素高剂量组大鼠血清IL-6、IL-1β含量均降低(均为P<0.05);与金合欢素高剂量组比较,金合欢素+EX527组大鼠血清IL-6、IL-1β含量均升高(均为P<0.05)(表3)。
2.6 各组大鼠晶状体Sirt1、p-AMPK、AMPK、Nrf2蛋白表达水平比较
与对照组比较,模型组大鼠晶状体Sirt1、p-AMPK/AMPK、Nrf2蛋白表达水平均降低(均为P<0.05);与模型组比较,金合欢素低、高剂量组大鼠晶状体Sirt1、p-AMPK/AMPK、Nrf2蛋白表达水平均升高(均为P<0.05);与金合欢素低剂量组比较,金合欢素高剂量组大鼠晶状体Sirt1、p-AMPK/AMPK、Nrf2蛋白表达水平均升高(均为P<0.05);与金合欢素高剂量组比较,金合欢素+EX527组大鼠晶状体Sirt1、p-AMPK/AMPK、Nrf2蛋白表达水平均降低(均为P<0.05)(图2和表4)。










3 讨论
根据糖尿病和白内障的流行病学和人口学趋势,临床中可能会愈加频繁地遇到这两种合并症的患者,且糖尿病患者比健康患者更容易需要接受白内障手术,DC患者的治疗已成为临床诊疗中医生关注的重点之一[12]。金合欢素是一种二羟基和单甲氧基黄酮,具有多种药理活性,包括抗癌,预防缺血-再灌注心肌梗死引起的心脏损伤、脂多糖诱导的神经炎症、脂多糖和败血症诱导的肺损伤、类风湿和胶原诱导的关节炎,抑制微生物生长、病毒介导的感染以及肝脏保护作用等[13]。DC是一类氧化应激损伤类疾病,本研究主要探究金合欢素对DC氧化应激损伤的影响及调控机制。
本研究构建和筛选DC大鼠模型,其晶状体混浊评分升高,晶状体上皮细胞呈现片状、条索状,且发生迁移性聚集现象,呈现典型的白内障病理特征,提示DC大鼠模型构建成功。糖尿病是一种慢性代谢性疾病,糖尿病存在时间长会引起严重的高血压,这也是预测糖尿病视网膜病变发生的一个指标[14]。本研究也发现,DC大鼠收缩压异常升高,说明长时间的糖尿病引发了高血压。氧化损伤在白内障的病因学中占据重要地位,抗氧化剂已被证实能够延迟和预防白内障发生,如使用维生素C补充剂可延缓玻璃体切割术后白内障的发生,改善糖尿病人群的生活质量[15]。MDA和SOD是氧化应激的标志蛋白,ROS在应激状态下产生MDA,SOD负责清除过多的ROS保护细胞免受伤害[16]。GSH-Px也是一种抗氧化酶,能够保护脉管系统免受ROS的影响,维持血管功能[17]。本研究发现,DC大鼠血清MDA含量升高,SOD、GSH-Px含量降低,说明存在严重的氧化损伤;金合欢素不仅可以改善DC大鼠的高血压,还能抑制氧化应激反应。眼内由于脉管系统的存在,将免疫细胞输送到发育不全、损伤部位等其他病理位置,免疫细胞释放的细胞因子通过诱导炎症和纤维化而损害视力[18]。IL-6、IL-1β是两种代表性促炎因子,白内障患者术后泪液IL-6、IL-1β水平的升高与不良临床事件的发生密切相关[19]。本研究中,DC大鼠血清IL-6、IL-1β含量升高,炎症反应可能加剧了疾病的进展,金合欢素可以抑制促炎因子水平的升高。
Sirt1可以调控细胞自噬、凋亡、线粒体功能等多种生理过程,也可以调控AMPK[20]。通过激活AMPK使其磷酸化可以减轻氧化应激诱导的晶状体上皮细胞衰老,缓解白内障的形成和发展[21]。Nrf2是一种应激反应性转录因子,使细胞能够抵抗氧化、异生素以及营养或蛋白毒性损伤,AMPK可以激活Nrf2,控制氧化还原平衡和炎症反应,调整细胞稳态[22]。本研究中,DC大鼠晶状体Sirt1、p-AMPK/AMPK、Nrf2蛋白表达水平降低,说明Sirt1/AMPK/Nrf2信号通路被抑制,这可能使机体氧化应激和炎症反应水平升高,进一步加剧DC;金合欢素处理DC大鼠可以提高Sirt1、p-AMPK/AMPK、Nrf2的蛋白表达水平,促进细胞稳态;Sirt1抑制剂EX527和金合欢素联合使用干预DC大鼠的效果和对Sirt1/AMPK/Nrf2轴的影响明显,提示金合欢素可能通过激活Sirt1/AMPK/Nrf2轴保护DC大鼠免受氧化应激损伤。
4 结论
金合欢素可能通过激活Sirt1/AMPK/Nrf2轴保护DC大鼠免受氧化应激损伤。Sirt1/AMPK/Nrf2信号通路对机体的调控是多方面的,除了在氧化应激方面的研究,下一步实验将重点关注能量稳态、细胞凋亡等方面的变化,丰富金合欢素的用药依据。