《眼科新进展》  2024年6期 428-432   出版日期:2024-06-03   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
玻璃体内注射原纤维蛋白-2 (FBN2)重组蛋白对FBN2缺陷型视网膜病变的影响


黄斑变性是临床常见的致盲性眼病,可导致患者不可逆的视力损害和失明。原纤维蛋白-2(FBN2)错义突变是导致年龄相关性黄斑变性(AMD)和早发性黄斑变性的主要原因。目前,临床上采用血管内皮生长因子拮抗剂和光动力疗法治疗湿性AMD,但常会引起视网膜神经节细胞和神经元细胞凋亡[1],对于干性AMD尚无安全有效的治疗方法[2-3]。本课题组前期研究表明,玻璃体内注射腺相关病毒(AAV)进行FBN2敲减,可以构建FBN2缺陷型视网膜病变疾病模型[4]。我们推测玻璃体内注射FBN2重组蛋白可用来治疗FBN2缺陷型视网膜病变。因此,本研究探讨玻璃体内注射FBN2重组蛋白对FBN2缺陷型视网膜病变的影响。
1 材料与方法 
1.1 材料 
1.1.1 实验动物及分组
取8周龄 SPF级C57BL/6J 小鼠32只(购自北京维通利华实验动物技术有限公司),体重21~23 g,入组前对小鼠进行眼部筛查,排除角膜病、白内障以及眼底疾病。随机分为 4组:正常对照组、阴性对照组、FBN2敲减组、FBN2重组蛋白组,每组8只小鼠,取右眼作为实验眼。入组后,正常对照组小鼠不进行干预,阴性对照组小鼠玻璃体内注射3 μL 空载体(1 mg·L-1[5],FBN2敲减组及FBN2重组蛋白组小鼠玻璃体内注射3 μL AAV(1 mg·L-1),4周后FBN2重组蛋白组小鼠玻璃体内注射3 μL FBN2重组蛋白(1 mg·L-1)。本研究动物处理遵循《实验动物管理条例》(2017修订版)的规定。
1.1.2 试剂与仪器
光学相干断层扫描(OCT)仪(德国海德堡公司),视网膜电图(ERG)视觉电生理仪(英国Optorobe Science有限公司),氧氟沙星滴眼液(山东辰欣佛都药业有限公司),敲减FBN2载体AAV (上海吉满生物科技有限公司),LightCycler 480 II RT-PCR 仪(美国Roche 公司)等。
1.2 方法
1.2.1 FBN2缺陷型视网膜病变动物模型的制备

取FBN2敲减组及FBN2重组蛋白组小鼠先腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥钠溶液(50 mg·kg-1)进行麻醉,用复方托吡卡胺滴眼液散瞳。麻醉后,进行玻璃体内注射,于颞侧角巩膜缘后2 mm垂直巩膜进针,有突破感后针头向眼球后极部倾斜,在显微镜下透过小鼠角膜观察针尖在玻璃体内的位置,避免刺伤晶状体和视网膜,注入3 μL AAV(5 ’-GCACATACAATGTCGGCAAAG-3’)进行造模。
1.2.2 ERG检测
将每组小鼠置于黑暗环境 8 h以上进行暗适应。检测时保持室内黑暗环境,先腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥钠溶液(50 mg·kg-1)进行麻醉,复方托吡卡胺滴眼液散瞳。将动物置于操作台上,采用RETI port系统,将环状角膜电极固定在小鼠双眼角膜,将ERG视觉电生理仪针状参考电极分别插入小鼠口中左右口角两侧肌肉丰厚处,针状接地电极缓慢扎入小鼠右上肢皮下肌肉,待检测屏上地线稳定后开始记录,每只鼠检测3次,分析Rod-b、Max-a振幅变化。
1.2.3 OCT检测
取各组小鼠先腹腔注射10 g·L-1戊巴比妥钠溶液(50 mg·kg-1)进行麻醉,复方托吡卡胺滴眼液散瞳,检测眼配戴屈光度为-25 D、直径为3 mm的角膜接触镜,将小鼠眼睛对准扫描镜头,调整小鼠位置、镜头距离,每只小鼠至少获取3张图片。
1.2.4 RT-PCR检测
每组各随机选取4只小鼠进行检测,视网膜组织总RNA的提取和RT-PCR检测按照经典方法进行。使用反转录试剂盒进行反转录。采用RT-PCR仪检测FBN2 mRNA 表达。FBN2上游引物序列为5’- GTGTAACTGCCCGCCTGACTTCC -3’,下游为5’ ACCTACGCCGACCTCTGTGTTGC -3’; I型胶原蛋白(COL1)上游引物序列为5’-CTCCCGTGGCTTCTAGTGC-3’,下游为5’-GCCTTAGTTTGGACAGGATCTG-3’ ; 微原纤维相关糖蛋白(MAGP)-2上游引物序列为5’-TGGCCCAGAAACAGACCCTTACTT-3’,下游为5’-ACACAGCGGCCGTTTTCACAA-3’;β-actin上游引物序列为5’GTGAGCCTTCTTCCTGTTAG -3’,下游为5’CATTCAGCTCCGCAAGACTT -3’。采用2-ΔΔCt法定量分析mRNA的相对表达量。
1.2.5 Western blot检测
每组各随机选取4只小鼠进行检测,取视网膜组织用RIPA裂解液覆盖,按质量体积比1∶10 (mg∶μL)加入1 mmol·L-1苯基甲基磺酰氟,加入液氮研磨,8 000 r·min-1离心5 min,收集上清。采用SDS-PAGE和聚偏二氟乙烯膜对样品进行分离和转移。加一抗FBN2 (1∶1 000)、MAGP-2(1∶1 000)、COL1 (1∶10 000),4 ℃孵育过夜。IRDye 800CW山羊抗兔(1∶2 000)IgG (zb2301)或IRDye 800CW山羊抗小鼠(1∶2 000)IgG (zb2305)抗体在室温下孵育2 h。最后,使用Fusion-fx7成像系统(法国Vilber Lourmat公司)DAB进行可视化,并使用Fusion CAPT Software (法国Vilber Lourmat公司)进行分析。
1.3 统计学分析
采用 SPSS 21.0软件对实验数据进行统计分析,计量资料用均数±标准差表示,数据均符合正态分布且方差齐性,采用方差分析进行多组间比较,检验水准:α=0.05。
2 结果 
2.1 各组小鼠ERG检测结果
ERG检测结果显示,与阴性对照组和正常对照组相比,FBN2敲减组小鼠视网膜ERG Rod-b、Max-a波振幅均变小(均为P<0.05);与FBN2敲减组相比,FBN2重组蛋白组视网膜ERG Rod-b、Max-a波振幅均明显增加(均为P<0.05)(表1)。



2.2 各组小鼠OCT 检测结果
OCT 检测结果显示,与阴性对照组和正常对照组相比,FBN2敲减组小鼠视网膜色素上皮层不规则,出现高密度反射区;与FBN2敲减组相比,FBN2重组蛋白组小鼠视网膜色素上皮层组织结构恢复正常,光反射变规则(图1)。
2.3 各组小鼠视网膜组织FBN2、COL1、MAGP-2 mRNA表达情况
RT-PCR检测结果显示,与阴性对照组和正常对照组相比,FBN2敲减组小鼠视网膜组织FBN2 mRNA表达均明显降低,COL1、MAGP-2 mRNA表达均明显升高(均为P<0.05);与FBN2敲减组相比,FBN2重组蛋白组小鼠视网膜组织FBN2 mRNA表达明显升高,COL1、MAGP-2 mRNA表达均明显降低(均为P<0.05)(表2)。
2.4 各组小鼠视网膜组织FBN2、COL1、MAGP-2 蛋白表达情况
Western blot检测结果显示,与阴性对照组和正常对照组相比,FBN2敲减组小鼠视网膜组织FBN2 蛋白表达均明显降低,COL1、MAGP-2蛋白表达均明显升高(均为P<0.05);与FBN2敲减组相比,FBN2重组蛋白组小鼠视网膜组织FBN2蛋白表达明显升高,COL1、MAGP-2蛋白表达均明显降低(均为P<0.05)(图2和表3)。













3 讨论
FBN2变异可导致复杂形式的视网膜变性,FBN2缺乏症患者的主要临床特征包括视力扭曲、视物变形、黄斑变性和黄斑色素上皮萎缩。有研究表明,FBN2蛋白位于Bruch膜上,在AMD眼中表达减少[6]。我们前期研究发现,以AAV为载体进行FBN2干扰可以降低FBN2在视网膜上的表达,诱发FBN2缺陷型视网膜病变[4]。在此基础上,本研究对FBN2缺陷型视网膜病变小鼠行玻璃体内注射FBN2重组蛋白,旨在探讨FBN2重组蛋白对FBN2缺陷型视网膜病变的治疗效果。在本研究中,我们发现玻璃体内注射FBN2重组蛋白后,ERG检测发现Rod-b波振幅(暗适应)、Max-a波振幅(暗适应)明显上升,FBN2缺陷型视网膜病变小鼠视网膜组织结构恢复,视网膜中内源性FBN2 mRNA和蛋白表达升高,MAGP-2和COL1 mRNA和蛋白表达降低。这意味着FBN2重组蛋白可能通过调节FBN2、MAGP-2和COL1基因表达来干预FBN2缺陷型视网膜病变进程,借助外源性蛋白治疗能弥补特定的内源性蛋白缺失,可以有效治疗疾病。
传统的用于治疗视网膜病变的方法均存在一定程度的局限性,如血管内皮生长因子拮抗剂仅能使1/3视网膜病变患者的视力得到恢复。在大鼠实验研究中,采用血管内皮生长因子拮抗剂治疗糖尿病视网膜病变,可导致视网膜神经节细胞和视网膜内核层神经元细胞凋亡[7-8]。光动力疗法仅适用于湿性AMD患者,有效率仅为14%~30%,0.7%的治疗患者可能出现急性严重视力障碍[9-10]。此外,视网膜色素上皮移植术有很大的概率(75%)引起移植排斥反应[11-12]。本研究中,玻璃体内注射FBN2重组蛋白能有效改善小鼠视网膜病变的病理进程,并可以有效避免以上传统治疗方法中的局限性。有研究发现,眼内注射双调蛋白抗体可降低视网膜组织中双调蛋白的表达,抑制透镜诱导的近视豚鼠眼轴延长,表明玻璃体内注射抗体可成功通过视网膜屏障作用于靶向视网膜细胞[13]。在本研究中,玻璃内注射FBN2重组蛋白后,小鼠ERG振幅和视网膜结构明显恢复,这表明补充外源性FBN2重组蛋白可以恢复视功能,逆转视网膜病理改变。因此,玻璃体内注射FBN2重组蛋白可作为治疗FBN2缺陷型视网膜病变的有效候选药物,这为基因缺陷性视网膜病变的靶向干预提供理论依据。
微原纤维在器官发生过程中通过调节弹性蛋白沉积来调节弹性纤维的组装[14]。微原纤维最大的成分包括FBN1、FBN2[15]。纤维蛋白基因的突变与结缔组织疾病有关,在微原纤维的功能和组装中起着关键作用。原纤维蛋白通过相关微纤维分子的复杂网络发挥其功能,如MAGPs。 MAGP-1和MAGP-2是两种结构相关的小微纤维蛋白,它们都通过含有7个常见半胱氨酸残基的羧基末端区域与FBN1结合,这些残基在MAGP-2和MAGP-2之间守恒[16]。几种导致马凡综合征的FBN-1突变已被定位到结合MAGP-2的7-cbEGF重复序列包含区域[17],证实MAGP-2在微原纤维和细胞外基质的生物代谢过程中与纤维蛋白的功能相关。MAGP-2是一种小基质蛋白,整合素结合在其N端,可介导COL1表达升高[18]。 FBN1与FBN2功能与结构相似[19]。有研究发现,MAGP-2在硬皮病患者和皮肤增厚小鼠的纤维化皮肤中表达升高, MAGP-2过表达会促进COL1的表达,说明MAGP-2在调节细胞外基质稳态、促进纤维化中均发挥重要作用[20]。在本研究中,我们发现敲减FBN2后,MAGP-2与COL1表达升高,说明MAGP-2能促进COL1在基质中的沉积,这对进一步理解FBN2缺陷型视网膜病变的发病机制和靶向治疗提供理论依据。
4 结论
玻璃体内注射FBN2重组蛋白可以弥补FBN2缺陷型小鼠内源性缺失,通过调控MAGP-2、COL1表达达到治疗视网膜病变的作用。