《眼科新进展》  2023年5期 352-356   出版日期:2023-05-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
不同光谱组成的人工照明对视网膜色素上皮细胞的影响


已有文献报道,户外活动是视力的独立保护因素[1]。户外光照强度增加可以提高视网膜组织多巴胺水平,从而抑制近视的发生与发展[2-4]。另外,太阳光是一种全光谱,呈连续性,而室内光源由红、绿、蓝三基色混合而成,光谱覆盖范围小,蓝光对眼危害大[5]。研究表明,和日光灯相比,全光谱照明对幼兔的眼球视网膜组织超微结构影响更小[6],更有利于缓解豚鼠近视的发生[7]。类太阳光光谱LED照明可缓解儿童近距离用眼时引起的视网膜血流灌注降低,延缓近视的发生与发展[8]。应用高照度的全光谱照明设备是延缓近视发展的一种重要手段[9]。本研究旨在探讨不同光谱组成的人工照明对视网膜色素上皮(RPE)细胞的影响。
1 材料与方法 
1.1 主要试剂与仪器 DMEM/F12培养基、胎牛血清(美国HyClone公司),人RPE细胞系ARPE-19细胞(上海赛百慷生物技术股份有限公司),全光谱照明灯、非全光谱照明灯(深圳市科曼医疗设备有限公司),照度计(日本Konica Minolta公司),CCK-8试剂(上海翊圣生物科技有限公司),胰蛋白酶(苏州新赛美生物科技有限公司),线粒体膜电位检测试剂盒(TMRE)(美国赛默飞世尔科技公司);SpectraMax iD5 多功能酶标仪(美国美谷分子仪器有限公司),倒置荧光显微镜(日本NiKon公司)。
1.2 方法 
1.2.1 细胞培养 采用含体积分数10%胎牛血清和体积分数1%青链霉素的DMEM/F 12培养基培养ARPE-19细胞。将细胞置于37 ℃、体积分数5%CO2的培养箱中进行培养,每2 d换液1次。
1.2.2 细胞分组 将细胞随机分组:无光照对照组、非全光谱照明组(细分为300 lx、600 lx两个亚组)、全光谱照明组(细分为100 lx、300 lx、600 lx、900 lx 四个亚组),无光照对照组细胞避光培养,其他组细胞采用相应光谱和光照强度照射干预细胞。
1.2.3 光照条件的建立 将全光谱或非全光谱LED照明灯置于细胞培养箱内正上方对细胞进行照射,无自然光干扰。在细胞培养板上覆盖不同厚度的匀光膜,用照度计测量细胞生长平面的光照强度,调节至目标值。各组实验重复3次。
1.2.4 细胞形态学观察 将分组光照24 h、48 h、72 h后的ARPE-19细胞置于倒置荧光显微镜下,观察各组细胞的形态变化。
1.2.5 CCK-8法检测细胞活力 取ARPE-19细胞消化、离心,以每孔4×103个细胞接种于96孔板上,置于37 ℃细胞培养箱中孵育。在细胞贴壁生长后弃上清,加入无血清培养基饥饿8 h后换成含体积分数2.5%胎牛血清的DMEM/F 12培养基。无光照对照组细胞避光培养,其他组细胞分别在不同光照条件下照射24 h、48 h、72 h。每组设4个复孔。孵育结束后弃上清,每孔加入100 μL DMEM/F 12培养基+10 μL CCK-8溶液。在培养箱中孵育2 h后用酶标仪检测450 nm波长处各组吸光度(A),计算细胞活力。细胞活力=(A实验组-A空白组)/(A正常对照组-A空白组)。
1.2.6 线粒体膜电位法检测线粒体功能 取ARPE-19细胞接种于12孔板中,每孔8×103个细胞,按照分组光照细胞24 h、48 h及72 h。孵育结束后弃上清,用PBS清洗2次。根据说明书配置并添加TMRE试剂。避光孵育20 min,弃上清,PBS清洗1次,加入含体积分数2.5%胎牛血清的DMEM/F 12培养基 1 mL。倒置荧光显微镜下观察并拍照,使用ImageJ分析各组荧光强度,量化线粒体膜电位。通过计算获得线粒体膜电位相对荧光强度(以无光照对照组干预24 h的荧光强度为基数)。
1.3 统计学方法 采用Graphpad Prism Versiom 6软件对数据进行分析。计量资料采用均数±标准差表示,两样本间比较采用t检验。检验水准:α=0.05。
2 结果 
2.1 不同照明对细胞形态学的影响 光学显微镜下可见,光照24 h、48 h后,各组细胞在显微镜下呈单层贴壁生长,分布均匀,形态清晰;细胞大多呈梭形或类圆形,细胞胞浆透明,边界清。光照72 h后,各组细胞密度明显增大,细胞大小不一,细胞多边形不典型;全光谱照明组细胞较非全光谱照明组细胞形态较规整,异形细胞数少(图1)。



2.2 不同照明对ARPE-19细胞活力的影响 CCK-8法检测结果显示:光照24 h后,与无光照对照组相比,非全光谱照明300 lx组,全光谱照明300 lx、600 lx、900 lx组细胞活力均降低(均为P<0.05)。全光谱照明900 lx组细胞活力高于非全光谱照明300 lx组(P<0.05)。光照48 h后,各组细胞活力较光照24 h时提高;全光谱照明100 lx、300 lx组细胞活力低于非全光谱照明600 lx组(均为P<0.05)。光照72 h后,非全光谱照明300 lx、600 lx组,全光谱照明100 lx、300 lx组细胞活力低于无光照对照组(均为P<0.05);全光谱照明300 lx、600 lx、900 lx组细胞活力高于非全光谱照明300 lx、600 lx组(均为P<0.05)(表1)。
2.3 不同照明对线粒体功能的影响 ARPE-19细胞线粒体膜电位检测结果显示:光照24 h后,非全光谱照明600 lx组ARPE-19细胞线粒体膜电位相对荧光强度低于无光照对照组(P<0.05);全光谱照明100 lx、600 lx、900 lx组ARPE-19细胞线粒体膜电位相对荧光强均度高于非全光谱照明600 lx组(均为P<0.05)。光照48 h后,除全光谱照明100 lx组外,其余各光照组ARPE-19细胞线粒体膜电位相对荧光强度均低于无光照对照组(均为P<0.05);全光谱照明100 lx、600 lx、900 lx组ARPE-19细胞线粒体膜电位相对荧光强度均高于非全光谱照明300 lx组(均为P<0.05)。光照72 h后,非全光谱照明300 lx、600 lx组,全光谱照明300 lx组ARPE-19细胞线粒体膜电位相对荧光强度均低于无光照对照组(均为P<0.05);全光谱照明600 lx组ARPE-19细胞线粒体膜电位相对荧光强度高于非全光谱照明300 lx组(P<0.05);全光谱照明100 lx、600 lx、900 lx组ARPE-19细胞线粒体膜电位相对荧光强度高于非全光谱照明600 lx组(均为P<0.05)(图2和表2)。







3 讨论
光照对视网膜的损害主要有三种方式:热损伤、机械伤、光化学损伤[10],对于眼部健康影响最多的是光化学损伤。视网膜光化学损伤主要累及光感受器和RPE细胞[11]。RPE细胞位于视网膜的最外层,在视觉发生过程中起着关键的作用。研究表明,RPE细胞含有酪氨酸羟化酶[12],并能分泌多巴胺[13],而光照刺激能影响RPE细胞分泌多巴胺。RPE是一些视网膜疾病中最早受损伤的靶组织[14]。各种原因引起的视网膜光化学损伤,均可导致RPE细胞变性、损伤,最终导致视网膜功能异常而致视力丧失[15]。因此,本研究中我们选用RPE细胞作为研究对象。
本研究结果显示,光照24 h后,除全光谱照明900 lx组细胞活力高于非全光谱照明300 lx组外,其余各光照组ARPE-19细胞的细胞活力无明显差异。光照48 h后,各组ARPE-19细胞活力较光照24 h提高,这与孙敏等[16]的研究结果相一致。光照对细胞的损伤有一定的时间累积效应,光照后,随着培养时间的延长,轻度损伤的细胞能恢复活力,随后进行正常的增殖。陈灿等[17]的研究结果显示,光照48 h后,相同光照强度下全光谱照明组较非全光谱照明组细胞活力降低,而本实验结果显示两组之间差异无统计学意义,这可能与两者实验照度选择的高低不同有关。本实验结果显示,光照72 h后,相同光照强度下全光谱照明组较非全光谱照明组细胞活力升高。同一光谱组成的较高强度光照与较低强度光照相比,细胞活力差异不明显。
线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。本实验结果显示,光照时间越长,各组ARPE-19细胞线粒体膜电位相对荧光强度越低。在相同的照度下,全光谱照明组相较于非全光谱照明组更多时候表现出更好的细胞形态,更高的线粒体膜电位相对荧光强度。这可能与两者之间的光谱组成不同相关。全光谱照明减少了蓝光的比例,加重了长波红光的比例。研究表明,蓝光可致RPE细胞凋亡,线粒体膜电位降低[18-19],而红光是长波光,近红外光(670 nm)可被线粒体细胞色素氧化酶吸收,它在线粒体修复以及提高线粒体膜电位中起到了重要的作用,能改善年龄相关性视网膜病变组织的炎症反应[20-21]
本研究验证了不同光谱、不同照度对体外培养ARPE-19细胞活力及线粒体膜电位的影响,结果提示全光谱照明相对于非全光谱照明对ARPE-19细胞损伤更小。未来,我们将在实验动物水平上进一步验证全光谱照明对近视防控的疗效和安全性。