《眼科新进展》  2023年5期 346-351   出版日期：2023-05-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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二甲双胍对高糖诱导的RF/6A细胞增殖、迁移和血管形成的影响及其可能机制


糖尿病视网膜病变（DR）是2型糖尿病患者常见的微血管并发症，也是劳动年龄人群失明的主要原因之一。DR的特征是视网膜微血管功能和完整性发生改变，导致视网膜进行性缺血，最终促使其新生血管形成。尽管关于DR新生血管形成的研究繁多，但其潜在的分子机制仍不清楚。近年来，Hippo信号通路与DR之间的关系成为研究热点，越来越多的证据表明，Hippo信号通路在DR视网膜新生血管形成的过程中起着突出作用。
二甲双胍（MET）是一种廉价且安全的双胍衍生物，被广泛用于2型糖尿病治疗的一线药物。MET治疗DR的作用机制存在抑制血管内皮生长因子（VEGF）信号转导、抑制视网膜炎症反应、改善胰岛素抵抗等多种学说^［1-3］。以往许多研究证实了MET对DR患者和动物模型的有益作用^［4-5］。同时，MET作为Hippo信号通路的阻断剂，已在细胞水平证实它可通过Hippo信号通路起到抑制肿瘤的作用^［6］。基于此，我们设计本实验来观察MET对高糖诱导的恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞RF/6A增殖、迁移和血管形成的影响，并分析其与Hippo信号通路的关系，为开发新的DR治疗方法提供参考。
1　材料与方法　
1.1　材料　
1.1.1　实验细胞　RF/6A细胞购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.1.2　主要实验试剂及仪器　特级胎牛血清、MEM（ATCC改良）基础培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司）；D-无水葡萄糖、MET、组织细胞固定液（多聚甲醛）、结晶紫染色液、RIPA细胞裂解液、PMSF溶液、蛋白质上样缓冲液（北京索莱宝科技有限公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8）（美国GLPBIO公司）；Matrigengel（上海诺娃医药科技有限公司）；MonScript^TM RTIII All-in-One Mix with dsDNase、MonAmp^TM 2×Taq Mix Pro（ +Dye）（莫纳生物科技有限公司）；一步法Western blot专用封闭液（北京康为世纪生物科技有限公司）。酶标仪（南宁博美生物科技有限公司）；核酸检测仪（北京凯奥科技发展有限公司）；凝胶成像分析仪（上海天能科技有限公司）。
1.2　方法　
1.2.1　细胞培养　将RF/6A细胞置于含体积分数10%特级胎牛血清的MEM（含1000 mg·L^-1D-葡萄糖）完全培养基中，在37 ℃、体积分数5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱中正常培养。每周换液2～3次。当细胞融合度超过80%时进行传代处理，传代比例为1∶2～1∶4。取复苏后第2代至第5代对数生长期的RF/6A细胞进行消化、重悬、计数，用于实验。
1.2.2　CCK-8法检测MET对高糖诱导的RF/6A细胞增殖活性的影响　取RF/6A细胞制成 1.2×10⁵个·mL^-1的细胞悬液，以每孔100 μL接种于96孔板上，在MEM基础培养基（无血清）中饥饿24 h后，NC组细胞置于MEM基础培养基中培养48 h，HG组细胞置于高糖培养基（含4500 mg·L^-1D-葡萄糖）中培养48 h，HG+15 mmol·L^-1 MET组、HG+30 mmol·L^-1 MET组、HG+45 mmol·L^-1MET组细胞分别置于含不同浓度（15 mmol·L^-1、30 mmol·L^-1、45 mmol·L^-1）MET的高糖培养基中培养48 h。然后，弃掉上清液，每孔加入含体积分数10% CCK-8的MEM基础培养基100 μL，孵育2 h后，使用酶标仪检测450 nm波长下的吸光度。
1.2.3　CCK-8法检测MET对RF/6A细胞毒性的影响　取按1.2.2方法饥饿了24 h的RF/6A细胞，NC组细胞置于MEM基础培养基中培养48 h，NC+15 mmol·L^-1 MET组、NC+30 mmol·L^-1 MET组、NC+45 mmol·L^-1MET组细胞分别置于含不同浓度（15 mmol·L^-1、30 mmol·L^-1、45 mmol·L^-1）MET的MEM基础培养基中培养48 h。然后，弃掉上清液，每孔加入含体积分数10% CCK-8的MEM基础培养基100 μL，孵育2 h后，使用酶标仪检测450 nm波长下的吸光度。
1.2.4　细胞划痕法检测MET对高糖诱导的RF/6A细胞迁移的影响　用记号笔在6孔板每孔的背面画5条平行的横线，每隔0.5～1.0 cm一条。取RF/6A细胞制成细胞浓度为1.5×10⁵个·mL^-1的细胞悬液，以每孔2 mL接种于6孔板上。培养至100%铺满板底后，用200 μL枪头垂直板底，垂直于背面的5条平行横线自上而下划痕。弃掉上清液，沿6孔板侧壁缓慢加入1 mL PBS，轻摇使板底铺满PBS后弃掉，重复3次，去除划下的细胞。NC组置于MEM基础培养基、HG组置于高糖培养基、HG+15 mmol·L^-1MET组置于含15 mmol·L^-1MET的高糖培养基中培养48 h。加药后0 h、48 h时，在倒置生物显微镜下拍照记录。采用ImageJ软件测量并计算细胞迁移率。细胞迁移率=（0 h划痕面积-48 h划痕面积）/0 h划痕面积×100%。
1.2.5　Transwell法检测MET对高糖诱导的RF/6A细胞迁移的影响　取RF/6A细胞制成细胞浓度为5×10⁴个· mL^-1的细胞悬液，以每孔200 μL接种于Transwell上室，在Transwell下室加入500 μL MEM完全培养基后培养24 h。然后，弃掉Transwell上室、下室中的液体。NC组的上室加入MEM基础培养基200 μL，下室加入含体积分数20%特级胎牛血清的MEM基础培养基500 μL。HG组、HG+15 mmol·L^-1MET组上室分别加入高糖培养基和含15 mmol·L^-1MET的高糖培养基200 μL，下室加入含体积分数20%特级胎牛血清的高糖培养基500 μL。培养48 h后，用40 g·L^-1多聚甲醛固定30 min，1 g·L^-1结晶紫染色液染色20 min。待自然干燥后，在倒置生物显微镜下随机取5个视野拍照记录。采用ImageJ软件测量细胞迁移数，所得细胞迁移数的平均值用于统计分析。
1.2.6　Matrigengel法检测MET对高糖诱导的RF/6A细胞血管形成的影响　取RF/6A细胞制成细胞浓度为1×10⁵个·mL^-1的细胞悬液，以每孔2 mL接种于6孔板上。待细胞贴壁后，弃掉上清液，NC组细胞置于MEM完全培养基、HG组细胞置于高糖完全培养基、HG+15 mmol·L^-1MET组细胞置于含15 mmol·L^-1MET的高糖完全培养基中培养 48 h。Matrigengel置于4 ℃冰箱过夜后，用MEM基础培养基稀释1倍。将Matrigengel以每孔50 μL加入96孔板中，孵育60 min使胶凝固。取培养了48 h的RF/6A细胞制成1.2×10⁵个·mL^-1的细胞悬液，以每孔100 μL接种于铺好胶的96孔板上，孵育6 h。然后，在倒置生物显微镜下随机取3个视野拍照记录。采用ImageJ软件测量血管的总长度，所得血管的总长度的平均值用于统计分析。
1.2.7　RT-PCR检测MET对高糖诱导的RF/6A细胞中YAP、TEAD1 mRNA表达的影响　取按 1.2.6 方法培养了48 h的RF/6A细胞，用TRIzol法提取RNA。使用核酸检测仪检测提取的RNA浓度和纯度并记录，要求样品的OD₂₆₀/OD₂₈₀处于1.8～2.0。然后，使用MonScript^TM RTIII All-in-One Mix with dsDNase合成第一链cDNA。PCR扩增反应组分为第一链cDNA、正向引物、反向引物各1 μL，MonAmp^TM 2×Taq Mix Pro（ +Dye）10 μL，ddH₂O 7 μL。反应程序为94 ℃预变性3 min，94 ℃变性15 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，72 ℃终延伸5 min（变性、退火、延伸循环25次）。反应程序结束后，取5 μL PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。通过凝胶成像分析仪对其进行拍照记录。采用ImageJ软件检测mRNA表达量并以β-actin为内参计算YAP、TEAD1的mRNA相对表达量。YAP：正向引物为5’-AACACTGGAGCAGGATGGTG-3’，反向引物为5’-GGGTTCGAGGGACACTGTAG-3’；TEAD1：正向引物为5’-CAAGGTTTGAGAATGGCCGATTT-3’，反向引物为5’-GTTGTGGCTCCGTGTTCACTATTT-3’；β-actin：正向引物为5’-CTCACCATGGATGATGATATCGC-3’，反向引物为5’-CACATAGGAATCCTTCTGACCCA-3’。
1.2.8　Western blot检测MET对高糖诱导的RF/6A细胞中YAP、TEAD1蛋白表达的影响　取按 1.2.6 方法培养了48 h的RF/6A细胞，用RIPA细胞裂解液和PMSF溶液（100 mmol·L^-1）（100∶1）裂解细胞，再用超声波细胞破碎仪进一步裂解。4 ℃ 12 000 r·min^-1离心30 min，用BCA法测定蛋白浓度。取上清液，加入相应体积的蛋白质上样缓冲液（4倍稀释）。100 ℃热浴10 min使蛋白变性，-80 ℃储存。SDS-PAGE电泳、转膜，用一步法Western专用封闭液封闭1 h。放入稀释好的一抗（均按 1∶1000稀释）中，4 ℃孵育过夜。1×TBST充分洗膜后放入稀释好的二抗（均按1∶2000稀释）中，常温孵育2 h。1×TBST充分洗膜后化学发光。采用 ImageJ 软件检测蛋白表达量,并以β-actin为内参计算 YAP、TEAD1的蛋白相对表达量。
1.3　统计学方法　采用GraphPad Prism 8统计学软件进行统计分析，数据以均数±标准差表示。多组间整体比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　MET对高糖诱导的RF/6A细胞增殖活性的影响　CCK-8法检测结果显示，与NC组比较，HG组RF/6A 细胞的增殖活性升高；与HG组比较，HG+15 mmol·L^-1MET组、HG+30 mmol·L^-1MET组和HG+45 mmol·L^-1MET组RF/6A细胞的增殖活性降低，差异均有统计学意义（均为P<0.001）（图1）。



2.2　MET对RF/6A细胞增殖的影响　CCK-8法检测结果显示，与NC组比较，NC+30 mmol·L^-1MET组和NC+45 mmol·L^-1MET组细胞增殖活性均降低，差异均有统计学意义（均为P<0.000 1）。而NC组与NC+15 mmol·L^-1MET组比较，细胞增殖活性差异无统计学意义（P=0.227 3），表明15 mmol·L^-1的MET对RF/6A细胞的存活率无影响，因此选择15 mmol·L^-1MET进行后续实验（图2）。



2.3　MET对高糖诱导的RF/6A细胞迁移的影响　细胞划痕法检测结果显示，NC组、HG组、HG+15 mmol·L^-1MET组RF/6A细胞迁移率分别为（10.790±0.948）%、（23.040±2.149）%、（2.823±1.188）%。与NC组比较，HG组RF/6A 细胞的迁移率升高（P<0.01）；与HG组比较，HG+15 mmol·L^-1MET组RF/6A 细胞的迁移率降低（P<0.01）（图3）。Transwell法检测结果显示，NC组、HG组、HG+15 mmol·L^-1MET组RF/6A细胞的迁移个数分别为（359.30±3.84）个、（772.80±65.68）个、（278.90±23.42）个。与NC组比较，HG组RF/6A 细胞的迁移个数增加（P<0.01）；与HG组比较，HG+15 mmol·L^-1MET组RF/6A 细胞的迁移个数减少（P<0.01）（图4）。







2.4　MET对高糖诱导的RF/6A细胞血管形成的影响　Matrigengel法检测结果显示，NC组KF/6A细胞的血管总长度为100.00±15.79,HG组、HG+15 mmol·L^-1MET组RF/6A细胞的血管相对总长度分别为212.80±20.64、88.82±13.92。与NC组比较，HG组RF/6A 细胞的血管相对总长度增加（P<0.05）；与HG组比较，HG+15 mmol·L^-1MET组RF/6A 细胞的血管相对总长度减少（P<0.01）（图5）。



2.5　MET对高糖诱导的RF/6A细胞中YAP、TEAD1 mRNA表达的影响　RT-PCR检测结果显示，与NC组比较，HG组RF/6A 细胞的YAP、TEAD1 mRNA相对表达量均增加（均为P<0.05）；与HG组比较，HG+15 mmol·L^-1MET组RF/6A 细胞的YAP、TEAD1 mRNA相对表达量均减少（均为P<0.05）（图6）。



2.6　MET对高糖诱导的RF/6A细胞中YAP、TEAD1蛋白表达的影响　Western blot法检测结果显示，与NC组比较，HG组RF/6A 细胞的YAP、TEAD1蛋白相对表达量均增加（均为P<0.05）；与HG组比较，HG+15 mmol·L^-1MET组RF/6A 细胞的YAP、TEAD1蛋白相对表达量均减少（均为P<0.05）（图7）。



3　讨论
DR是临床上十分常见的致盲性眼病。随着生活水平的改善和人口老龄化程度的加深，DR已成为全球重大公共卫生问题。DR新生血管发生的机制错综复杂。高血糖所导致的氧化应激、多元醇通路激活、蛋白激酶C活化、晚期糖基化终末产物堆积、炎症等不同程度地造成了视网膜微血管损伤，血-视网膜屏障的破坏和毛细血管无灌注导致视网膜缺血，促血管生成因子水平上调，从而驱动病理性新生血管形成^［7］。
Hippo信号通路最初是在果蝇身上发现的，与细胞的存活、生长、增殖、迁移、凋亡，组织、器官的生长发育，肿瘤的发生发展，免疫调节等众多生物学反应息息相关，是组织生长的关键调节因子。Hippo信号通路在哺乳动物细胞中的主要核心组分包含：激酶级联哺乳动物STE20样激酶1/2（MST1/2）和大肿瘤抑制因子激酶1/2（LATS1/2）；调节分子萨尔瓦多家族WW结构域蛋白1（SAV1）和MOB激酶激活剂1（MOB1）；以及下游效应因子YAP/含有PDZ结合位点转录共激活因子（TAZ）和TEADs。MST-LATS-YAP/TAZ-TEADs轴被称为Hippo信号通路的经典轴。而越来越多的证据表明，Hippo信号通路在DR的发病机制中也扮演着重要角色。在动物水平，视网膜组织中已经检测到TEAD和YAP的表达^［8-9］，并且它们在视网膜血管的形成和病理过程中都起着重要作用^［10-11］。Xing等^［12］的研究发现：高糖环境可促进RF/6A细胞增殖、迁移、小管形成并使YAP的mRNA和蛋白、VEGF及VEGF受体表达显著增加，而YAP沉默则抑制细胞迁移、血管形成和VEGF的表达。Hao等^［13］的研究进一步在动物水平揭示了Hippo信号通路与DR之间的关系：链脲佐菌素诱导的糖尿病SD大鼠的视网膜中LATS、TAZ、TEAD蛋白的表达水平明显升高，磷酸化MST和磷酸化YAP 的表达水平明显降低。本研究发现，高糖条件可促进RF/6A细胞增殖、迁移、血管形成，并使细胞中YAP、TEAD1的mRNA及蛋白表达水平升高，与既往的研究结果相符。
有大量文献描述了MET对新生血管的影响。陈冠吉等^［14］的研究表明，MET被初步证实能有效抑制大鼠肝癌新生血管。而在眼的相关研究中发现，MET能抑制小鼠角膜新生血管^［15］。与文献中描述的一致，本研究中，在高糖条件下，MET降低了RF/6A细胞的增殖活性，减少了RF/6A细胞的迁移个数、迁移率和血管的总长度。因此我们推测，MET对DR的作用是通过抑制新生血管形成来实现的。
MET作为2型糖尿病的一线药物，也具有抗肿瘤作用，能抑制肿瘤生长，降低癌症风险和改善预后，并具有安全性和可耐受性。MET可通过诱导腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，直接使YAP磷酸化，从而抑制YAP的转录活性。在细胞和动物水平，MET已被证实可通过AMPK非依赖性途径减少YAP的核定位，抑制乳腺癌的发展^［16］。Zhang等^［17］ 的研究表明，MET可使YAP磷酸化后失活，抑制YAP从细胞质到细胞核的移位，从而抑制其转录活性，进而抑制结直肠癌细胞PD-L1的表达。在本研究中，高糖诱导的RF/6A 细胞中YAP、TEAD1的mRNA及蛋白表达水平升高，MET可以下调YAP、TEAD1的mRNA及蛋白表达水平。故我们推测，MET对DR的作用机制可能与Hippo信号通路有关。
本研究结果显示，MET能抑制高糖诱导的RF/6A细胞增殖、迁移和血管形成，下调YAP、TEAD mRNA及蛋白的表达，提示MET对高糖诱导的RF/6A细胞的增殖、迁移和血管形成有抑制作用，其作用机制可能与Hippo信号通路有关。本研究首次在体外实验水平初步探索了MET在高糖条件下对RF/6A细胞增殖、迁移、血管形成的影响及其与Hippo信号通路的关系，为进一步了解Hippo信号通路在眼底新生血管疾病中的重要作用以及MET用于DR的治疗提供了新见解。但MET如何通过Hippo信号通路抑制高糖条件下RF/6A细胞的增殖、迁移、血管形成尚需要进一步研究来证实。另外，本研究仅做了体外细胞模型的实验，还需要在动物模型及人体试验中进一步验证。