《眼科新进展》 2023年1期
25-29
出版日期：2023-01-05
ISSN:1003-5141
CN:41-1105/R
多巴胺对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜新生血管的影响
在早产儿视网膜病变（ROP）中，未发育成熟的视网膜血管系统因相对性缺氧而导致病理性新生血管增加，其中血管内皮生长因子(VEGF)已经被证明是ROP发病的主要因素［1-2］。玻璃体内注射抗VEGF药物是目前治疗ROP的重要方法，对新生血管的抑制作用明显［3］。但也有研究表明，玻璃体内注射抗VEGF药物后视网膜细胞可通过上调转化生长因子（TGF）β2、结缔组织生长因子（CTGF）等细胞因子的表达加速纤维血管膜的形成［3］。我们在前期实验中发现，抗VEGF药物在形觉剥夺性近视（FDM）豚鼠模型中会使视网膜中多巴胺（DA）含量进一步下降［4］。而DA是视网膜中重要的神经递质，对视网膜正常发育、抑制近视有着重要影响［5］。有研究显示，DA本身即具有抗新生血管的作用，DA通过激活多巴胺D2受体（DRD2）来抑制VEGF介导的微血管通透性、增殖和迁移［6-9］。但外源性DA是否对视网膜新生血管有治疗作用鲜有研究进行证实。本研究拟通过建立氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型，并给予DA治疗，观察其对视网膜新生血管的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要试剂与仪器 DA、Quinpirole(DRD2激动剂)、异硫氰酸荧光素-葡聚糖（FITC-Dextran，相对分子质量2×106）（美国Sigma公司）；Spiperone（DRD2抑制剂）、山羊抗小鼠IgG（英国Abcam公司）；苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（中国Solarbio公司）；Q-PCR试剂盒（中国艾科瑞生物）；鼠单抗VEGF抗体（美国Santa公司）;OCT冰冻切片包埋剂（美国Sakura公司）；自制动物实验舱；测氧仪（建德分析仪器二厂,CY-12C）；冰冻切片机（CM1950，德国Leica公司）；正置荧光显微镜（BX51T,日本Olympus公司）。
1.1.2 实验动物及分组 180只健康清洁级7 d龄C57BL/6J小鼠，购于斯贝福生物技术有限公司，雌雄不限，体重（4.38±0.58）g。饲养环境：自然照明下12 h/12 h昼夜循环，维持环境温度为22~25 ℃，湿度为50%~70%，小鼠自由摄水、摄食。采用随机数字表法将180只小鼠随机分为空白组、OIR组、NaCl组、DA组、Quinpirole组、Spiperone组，每组30只。本研究经滨州医学院附属医院伦理委员会审批（批准号：20210808-78），实验动物的喂养和使用严格遵循滨州医学院动物管理委员会的相关规定。
1.2 方法
1.2.1 动物模型的建立 小鼠出生的当天记为0 d龄，参照Smith等［10］报道的造模方法，新生小鼠在正常氧环境下饲养至7 d龄时，OIR组、NaCl组、DA组、Quinpirole组、Spiperone组共150只小鼠及其哺乳母鼠放至密闭的动物实验舱中，舱内O2体积分数稳定在（75±2）%，温度为（23±2）℃，湿度为（55±2）%，每日光照12 h。在氧舱中饲养时为避免母鼠死亡，需每隔24 h开舱更换一次母鼠，开舱时间控制在10 min以内。待小鼠12 d龄时将小鼠及其哺乳母鼠放回正常环境饲养5 d。空白组小鼠始终在正常环境中饲养。
1.2.2 药物干预及取材 根据分组于小鼠12 d龄时给予相应的干预措施。NaCl组、DA组、Quinpirole组小鼠右眼玻璃体内分别注射8.5 g·L-1NaCl、15 mmol·L-1的DA溶液、602 μmol·L-1的Quinpirole溶液各1 μL； Spiperone组小鼠右眼玻璃体内注射浓度为154 μmol·L-1的Spiperone溶液1 μL，30 min后再注射15 mmol·L-1的DA溶液1 μL；OIR组不做药物干预。待小鼠17 d龄时，行后续实验。
1.2.3 视网膜组织的病理学观察 每组随机选取6只小鼠颈椎脱臼处死，摘取右侧眼球，固定后经常规脱水、OCT包埋后，制成8 μm切片，每组小鼠随机选取20张切片行HE染色，随机选取6张切片于400倍光学显微镜下观察小鼠视网膜情况，并对突破内界膜的血管内皮细胞核数进行计数。
1.2.4 视网膜铺片 使用40 g·L-1多聚甲醛制备浓度为50 g·L-1的FITC-Dextran造影液。每组随机选取3只小鼠经腹腔注射20 g·L-1水合氯醛麻醉，待疼痛反射消失后固定四肢，眼科剪打开胸腔，暴露心脏，头皮针针头自左心尖插入左心室并推入主动脉，小心剪开右心耳，缓慢推注FITC-Dextran造影液1 mL，肝脏、结膜等组织变为黄绿色为灌注成功。立即摘除眼球，在40 g·L-1多聚甲醛中固定3 h。在体式显微镜下沿角巩膜缘剪下角膜及虹膜组织，娩出晶状体和玻璃体，去除巩膜，以视盘为中心，将杯状视网膜放射状剪为4瓣，平铺于载玻片上，滴少量甘油后加盖玻片，荧光显微镜下观察，用Photoshop软件计算新生血管面积。
1.2.5 Q-PCR检测 每组随机选取10只小鼠颈椎脱臼法处死，分离出视网膜，按照试剂盒说明提取视网膜组织中总RNA，将RNA逆转录成cDNA，反应程序为42 ℃孵育2 min，37 ℃孵育15 min，85 ℃加热5 s，然后进行PCR扩增。VEGF上游引物为5’-ACTGGACCCTGGCTTTACTG-3’，下游引物为5’-GCAGTAGCTTCGCTGGTAGA-3’；GAPDH上游引物为5’-TGTCTCCTGCGACTTCAACA-3’，下游引物为5’-GGTGGTCCAGGGTTTCTTACT-3’。反应程序为95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃延伸30 s，循环40次。使用2-ΔΔCt法计算VEGF mRNA相对表达量。
1.2.6 Western blot检测 每组剩余小鼠均行颈椎脱臼法处死，收集视网膜后于冰上研磨并加裂解液裂解30 min，转移至EP管，4 ℃、12 000 r·min-1离心30 min，BCA法测定蛋白浓度，加入5×蛋白上样缓冲液煮沸15 min，经电泳、转膜后，50 g·L-1BSA室温封闭2 h，加入一抗（VEGF稀释度为1∶1000；GAPDH稀释度为1∶10 000），4 ℃孵育过夜，TBST冲洗3次，每次10 min，加入二抗室温孵育2 h，TBST冲洗3次，每次10 min，化学发光显影，ImageJ软件分析灰度值，以GAPDH为内参，计算VEGF蛋白相对表达量，实验独立重复 3次。
1.3 统计学方法 采用SPSS 25.0统计学软件进行统计分析，计量资料经W检验呈正态分布，以均数±标准差（x?±s）表示，组间数据经levene检验方差齐性，各组数据总体比较采用多组间单因素方差分析，组间的多重比较采用LSD-t检验。检验水准： α=0.05。
2 结果
2.1 各组小鼠视网膜组织切片中突破内界膜的新生血管生长情况 光学显微镜下可见，空白组小鼠视网膜内界膜平整，少有新生血管内皮细胞突入玻璃体，未发现与内界膜相连的伸入到玻璃体的新生血管。OIR组、NaCl组与Spiperone组小鼠视网膜中可见较多突破内界膜的血管内皮细胞，或单独出现，或成簇出现，并可见视网膜内界膜下的细胞增生，排列紊乱。与NaCl组相比，DA组小鼠视网膜可见少数突破内界膜的新生血管内皮细胞，DA组小鼠视网膜内界膜欠平整，突破内界膜的血管内皮细胞稍减少。Quinpirole组小鼠视网膜内界膜结构清晰，突破内界膜的血管内皮细胞明显减少，仅见少量的新生血管内皮细胞（图1）。
2.2 各组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数 空白组、OIR组、NaCl组、DA组、Quinpirole组、Spiperone组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数分别为（1.48±0.54）个、（51.09±1.20）个、（51.46±4.10）个、（31.12±1.61）个、（16.94±1.04）个、（50.59±1.63）个，各组间总体比较差异有统计学意义（F=644.738,P<0.05）。两两比较结果显示，OIR组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数明显高于空白组(P<0.05)；NaCl组、Spiperone组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数与OIR组相比差异均无统计学意义(均为P>0.05)；DA组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数较OIR组明显减少(P<0.05)；Quinpirole组小鼠视网膜中突破内界膜的血管内皮细胞核数较DA组明显减少(P<0.05)。
2.3 视网膜铺片 空白组小鼠的视网膜血管呈均匀网状结构分布，血管分支清晰可见，视网膜中央未见无灌注区及荧光渗漏区，未见异常的病理性新生血管；OIR组、NaCl组、Spiperone组小鼠视网膜可见大片的荧光渗漏区及迂曲扩张的病理性新生血管，血管走行极度紊乱。DA组小鼠视网膜大血管的迂曲情况好转，病理性新生血管减少，血管结构较清晰。Quinpirole组小鼠视网膜新生血管明显减少，血管走行渐规则，荧光渗漏区明显减少，血管网较清晰（图2）。
2.4 各组小鼠视网膜中新生血管面积 空白组、OIR组、NaCl组、DA组、Quinpirole组、Spiperone组小鼠视网膜中新生血管面积占视网膜血管总面积的百分比分别为0、（0.52±0.12)%、（0.51±0.01)%、（0.42±0.03)%、（0.26±0.03)%、（0.53±0.07)%，各组间总体比较差异有统计学意义(P<0.05)。与OIR组相比，NaCl组和Spiperone组小鼠视网膜中新生血管面积占比差异均无统计学意义(均为P>0.05);与OIR组相比，DA组小鼠视网膜中新生血管面积占比明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）;与DA组相比，Quinpirole组小鼠视网膜中新生血管面积占比明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。
2.5 各组小鼠视网膜中VEGF mRNA的相对表达量 空白组、OIR组、NaCl组、DA组、Quinpirole组、Spiperone组间小鼠视网膜中VEGF mRNA的相对表达量总体比较差异有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示，与空白组相比，OIR组小鼠视网膜中VEGF mRNA相对表达量明显升高（P<0.01）；与OIR组相比，NaCl组和Spiperone组小鼠视网膜中VEGF mRNA相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)；DA组小鼠视网膜中VEGF mRNA相对表达量明显低于OIR组（P<0.01）；Quinpirole组小鼠视网膜中VEGF mRNA相对表达量明显低于DA组（P<0.05）（图3）。
2.6 各组小鼠视网膜中VEGF蛋白的相对表达量 Western blot检测结果显示，与空白组相比，OIR组小鼠视网膜中VEGF蛋白的相对表达量明显升高（P<0.01）;与OIR组相比，NaCl组和Spiperone组小鼠视网膜中VEGF蛋白相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05);与OIR组相比，DA组小鼠视网膜中VEGF蛋白的相对表达量明显降低（P<0.05）;与DA组相比，Quinpirole组小鼠视网膜中VEGF蛋白的相对表达量明显降低（P<0.01）（图4）。
3 讨论
ROP中，VEGF诱导的受体磷酸化是启动下游信号通路导致血管生成或相关病理生理结果的关键步骤［1］。相对性缺氧增加了视网膜中VEGF的表达，过度分泌的VEGF通过与内皮细胞结合并磷酸化VEGFR-2，使新生血管长入玻璃体并导致局部毛细血管渗漏，严重时可导致视网膜脱离［11］。ROP患者接受抗VEGF治疗后仍出现残余视力丧失及高发的近视率［1］，一方面可能是ROP影响了中央视网膜和脉络膜的成熟，脉络膜成熟障碍无法为视网膜提供氧气和营养物质，导致光感受器受到长期损害［12］。另一方面可能是抗VEGF药物降低了视网膜DA的水平，使视网膜无法维持正常的视觉发育，导致高发的近视率［4］。
DA属于儿茶酚胺类物质，其受体存在于全身各器官和细胞中，具有多种生物学效应，如延缓近视进展、调节眼压、治疗弱视、影响新生血管生成、抗肿瘤等，且不良反应较少［13-15］。DA通过5种受体亚型发挥作用，分为两个家族：D1样受体（D1和D5）和D2样受体（D2、D3和D4）［5］。大量研究表明，DA的抗新生血管作用主要是通过D2受体来实现的［6-8,16-18］，DA不仅可以通过刺激D2受体来抑制肿瘤的病理性血管生成［19］，而且对创面生理性血管生成也有负面影响，特异性D2受体拮抗剂的治疗可以显著增加创面血管生成［9］。Hoeppner等［20］研究表明，DA和DRD2治疗可以通过抑制VEGF的表达、受体磷酸化及其下游信号通路减少小鼠肺癌模型中的新生血管形成。
本研究选择建立OIR模型，观察注射DA及相关药物后视网膜中VEGF的水平，及病理性新生血管的变化。鉴于视网膜含有丰富的抗坏血酸［21］，我们没有使用抗坏血酸作为DA的抗氧化剂，而是选择了可以有效溶解药物的8.5 g·L-1NaCl ［13］。关于药物浓度，新生小鼠玻璃体的体积约2 μL［22］，参考文献［13,23］计算出注射所需药物浓度。根据文献［13］，我们选择在注射Spiperone药物30 min后注射DA溶液。本研究结果表明，DA组较OIR组小鼠新生血管面积占比减少，且VEGF mRNA和蛋白的相对表达量均呈现相应下降趋势，这与Sinha等［18］的研究结果一致。Quinpirole激活DRD2后新生血管面积占比进一步减少，VEGF mRNA和蛋白的相对表达量均较DA组进一步下降，而Spiperone组小鼠在抑制DRD2后再注射DA，其新生血管面积占比及VEGF mRNA和VEGF蛋白的相对表达量与OIR组相比差异均无统计学意义。这说明DA减少新生血管形成的作用机制可能是通过激活DRD2使VEGF mRNA和蛋白的相对表达量下降实现的。Cristina等［24］研究结果表明，与野生型小鼠相比，DRD2基因敲除小鼠脑垂体中VEGF mRNA和蛋白的表达增加，而在野生型小鼠中，延长DRD2拮抗剂氟哌啶醇的治疗时间，可以促进脑垂体中VEGF的表达，这也说明了VEGF表达和DRD2呈负相关。
综上所述，DA能够抑制OIR小鼠视网膜新生血管的形成，其作用机制是通过激活DRD2来实现的。DA及Quinpirole在抑制视网膜新生血管的同时，也能够为视网膜的正常视觉发育提供DA，但其是否具有浓度依赖性以及最佳给药方式、给药时间及具体机制仍需进一步研究。目前对ROP的治疗主要以抑制新生血管为主，而DA在抑制新生血管的同时还能够支持视网膜的正常发育［25］，为治疗ROP提供了新思路。