《眼科新进展》  2023年1期 18-24   出版日期：2023-01-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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长链非编码RNA（LncRNA）母系表达基因3（MEG3）对糖尿病视网膜病变大鼠模型视网膜血管内皮细胞凋亡的影响


糖尿病视网膜病变（DR）是发生于糖尿病患者的微血管并发症，主要病理学特征包括视网膜血管内皮细胞受损、管腔变窄、视网膜神经节细胞凋亡等，可造成患者视力不同程度受损^［1-2］。高糖可导致炎症因子过量表达，引起内皮细胞凋亡。抗炎治疗是目前改善DR的有效方法^［3-4］。长链非编码RNA（LncRNA）母系表达基因3（MEG3）在DR患者体内表达明显减少，促进其表达可抑制炎症，降低汞诱导的人视网膜上皮细胞凋亡^［5］，并可通过抑制炎症因子的产生而减轻Müller细胞的胶质增生，延缓DR进展^［6］。miR-145-5p是一种调控炎症和细胞增殖与凋亡的重要微小RNA分子，转染miR-145-5p抑制剂可降低炎症因子表达，提高高糖环境下视网膜神经节细胞活力，抑制其凋亡。因此，miR-145-5p可能是治疗DR的重要靶点^［7-8］。有研究显示，在缺血再灌注损伤处理的肾脏细胞中，LncRNA MEG3可与miR-145-5p结合并下调其表达^［9］，但LncRNA MEG3是否可通过靶向miR-145-5p影响DR大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡，目前尚不清楚。本文通过构建DR大鼠及细胞模型，探讨LncRNA MEG3对DR大鼠模型视网膜血管内皮细胞凋亡的影响。
1　材料与方法　
1.1　材料　
1.1.1　实验动物与细胞　SPF级雄性SD大鼠购自宁波科瑞特动物药业有限公司，体质量为180~210 g。将大鼠分笼饲养，每笼不超过6只，在本院动物中心屏障环境下饲养1周后用于实验。本研究实验操作遵守3R原则，动物处理遵循《实验动物管理条例》（2017修订版）的规定。人视网膜微血管内皮细胞（HRMEC）、HRMEC完全培养基均购自武汉普诺赛生命科技有限公司。
1.1.2　主要试剂及仪器　链脲佐菌素（试剂级）、葡萄糖（纯度≥99.5%）、miR-145-5p与U6引物、LncRNA MEG3过表达质粒、miR-145-5p agomir、LncRNA MEG3空载质粒、miR-145-5p agomir阴性对照、野生型miR-145-5p报告质粒、突变型miR-145-5p报告质粒、RIPA裂解液均购自生工生物工程（上海）股份有限公司，伊文思蓝（EB）溶液（纯度≥85%）、Opti-MEM减血清培养基、总RNA提取试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒、即用型Hoechst 33258染色液（10 mg·L^-1）、脂质体2000、一步法实时荧光定量PCR试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，Cell-Light^TMEdU荧光显微镜检测试剂盒购自广州市锐博生物科技有限公司，双荧光素酶试剂盒购自美国Promega公司，白细胞介素（IL）-1β检测试剂盒、BCA蛋白质定量检测试剂盒、IL-6检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，兔源β-actin一抗、兔源Bcl-2一抗、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗、兔源Bax一抗均购自美国Abcam公司。
EnSpire^TM2300全自动酶标仪购自英国PerkinElmer公司，FSX100荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司，Stepone plus实时荧光定量PCR仪购自ABI公司，F96Pro荧光分光光度计购自上海棱光技术有限公司，CM3600 XP冷冻切片机购自德国Leica公司，Trans-Blot SD半干转膜系统、PowerPac Universal电泳仪、GelDox XR+凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司。
1.2　方法　
1.2.1　DR大鼠模型制备　参照文献［10］制备DR大鼠模型：将链脲佐菌素溶于0.1 mol·L^-1的柠檬酸缓冲液中，制成6 g·L^-1溶液；大鼠禁食12 h后，自腹腔按照10 mL·kg^-1剂量注入链脲佐菌素溶液，使其终剂量达到60 mg·kg^-1，72 h后测量大鼠尾静脉血样中血糖水平，每天测量3次，连续一周内血糖浓度均超过16.7 mmol·L^-1，表明DR模型建立成功。共成功构建DR模型大鼠60只，随机分为模型组、LncRNA MEG3过表达组、miR-145-5p agomir组、共转染组、共转染阴性对照组，每组分配12只大鼠，再取12只大鼠按照10 mL·kg^-1剂量自腹腔注入0.1 mol·L^-1柠檬酸缓冲液，作为对照组。
1.2.2　大鼠分组给药及视网膜血管通透性检测　参照文献［11］ 给予大鼠药物：LncRNA MEG3过表达组大鼠玻璃体内注射LncRNA MEG3过表达质粒（浓度参照说明书设定）；miR-145-5p agomir组大鼠玻璃体内注射miR-145-5p agomir（浓度参照说明书设定）；共转染组大鼠玻璃体内同时注射LncRNA MEG3过表达质粒和miR-145-5p agomir；共转染阴性对照组大鼠玻璃体内同时注射LncRNA MEG3空载质粒和miR-145-5p agomir阴性对照质粒，各组大鼠均每7 d注射1次，共注射9次。
视网膜血管通透性检测：第9次注射后7 d，每组随机选出6只大鼠，自尾静脉向其体内注射20 g·L^-1EB溶液5 mL，2 h后将大鼠置于充满乙醚气体的玻璃瓶中麻醉，然后取大鼠玻璃体，加入生理盐水研磨后离心，采用荧光分光光度计测出上清中EB含量，借此反映视网膜血管通透性。
1.2.3　大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡检测及标本采集　第9次注射后7 d，将每组剩余的6只大鼠以同样方法麻醉后取出房水，保存于-80 ℃备用。将取出房水后的大鼠，每组随机选出3只，取大鼠视网膜组织后平分为两份，一份存在液氮备用，另一份加入RIPA裂解液于冰水中高速研磨成浆，离心（4 ℃，20 min，1000 r·min^-1）后以BCA试剂盒测量上清液中蛋白总浓度，根据测量结果将各组蛋白浓度调至相同后置入-80 ℃保存备用；将剩余的3只大鼠取出视网膜组织后，包埋并置于液氮中快速冰冻成块状，使用冰冻切片机将其切为连续的薄片，自其中选出没有破损且厚薄均匀的切片，室温中静置5 min后，浸入冰丙酮中固定后以TUNEL试剂盒染色，漂洗后封片观察，随机采集5个视野图像，以ImageJ软件分析，计算细胞凋亡率（凋亡细胞数/总细胞数×100%）。
1.2.4　DR细胞模型制备及分组处理　将购买的HRMEC复苏后置于37 ℃含体积分数5%CO₂的培养箱中无菌培养，细胞融合度达到约80%时传代，然后接种在12孔板中无菌培养12 h，随机分为对照组、模型组、LncRNA MEG3过表达组、miR-145-5p agomir组、共转染组、共转染阴性对照组，对照组细胞以HRMEC完全培养基培养，其余5组细胞均以含有25 mmol·L^-1葡萄糖的HRMEC完全培养基培养24 h，诱导出DR细胞模型^［11］，然后严格遵照脂质体2000试剂盒说明书指导步骤分组转染质粒、miR-145-5p agomir及其阴性对照质粒。
1.2.5　细胞增殖、细胞凋亡检测及标本采集　细胞分组转染48 h后，弃去培养基，轻柔洗涤细胞后加入40 g·L^-1多聚甲醛溶液固定2 h，然后加入EdU，严格遵照Cell-Light^TMEdU荧光显微镜检测试剂盒说明书指导步骤检测细胞增殖情况，荧光显微镜下观察可发现EdU阳性细胞，即是增殖细胞，将对照组的EdU阳性细胞数作为标准，检测其余各组相对于对照组的EdU阳性细胞比例，即是各组细胞增殖率，对照组记为100%。
将传代的HRMEC接种在12孔板，以同样方法分组转染后48 h，弃去培养基，轻柔洗涤细胞后加入40 g·L^-1多聚甲醛溶液固定2 h，然后加入10 mg·L^-1的Hoechst 33258染色5 min，荧光显微镜下观察可发现凋亡细胞，将对照组的凋亡细胞数作为标准，检测其余各组相对于对照组的凋亡细胞比例，即是各组细胞凋亡率，对照组记为100%。
将传代的HRMEC接种在12孔板，以同样方法分组转染后48 h，收集各组细胞及其培养液备用。
1.2.6　大鼠房水中及HRMEC炎症因子IL-6、IL-1β含量检测　取出1.2.3中大鼠房水置于4 ℃冰箱中冻融，取1.2.5中备用的各组细胞培养液离心（4 ℃，20 min，1000 r·min^-1）,以试剂盒测量房水及细胞培养液离心后上清液中IL-6、IL-1β含量，具体步骤严格遵照试剂盒说明书指导进行。
1.2.7　HRMEC及大鼠视网膜组织miR-145-5p表达水平检测　取出1.2.3中存于液氮中的大鼠视网膜组织和1.2.5中备用的各组细胞，均以总RNA提取试剂盒将其中总RNA提取出来，然后通过一步法实时荧光定量PCR试剂盒进行PCR扩增实验，具体步骤及反应条件严格遵照试剂盒说明书指导进行，所得数据以算法2^-ΔΔCt进行计算。各基因引物序列见表1。
1.2.8　HRMEC及大鼠视网膜组织凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax表达水平检测　采用蛋白免疫印迹法检测HRMEC及大鼠视网膜组织凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax）表达。取出1.2.3中保存的大鼠视网膜组织蛋白样品液置于4 ℃冰箱中冻融，取1.2.5中备用的



各组细胞，以RIPA裂解液提取总蛋白后离心（4 ℃，20 min，1000 r·min^-1），以BCA试剂盒测量蛋白总浓度后调至各组相同，然后分别取上述各组大鼠视网膜组织及细胞蛋白样品液20 μL，加热变性蛋白后，依次进行电泳、半干转实验，封闭膜上蛋白非特异位点，孵育兔源抗大鼠Bcl-2、Bax及β-actin一抗，洗涤、孵育辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗，洗涤、显影，拍照后采集蛋白条带图像，并以 ImageJ 软件测定其灰度值，以内参β-actin为标准，计算各组蛋白的相对表达量，并进行统计分析。
1.2.9　LncRNA MEG3对miR-145-5p靶向调控的检测　将传代的HRMEC接种于24孔板，无菌培养12 h后随机分为6组：转染野生型miR-145-5p报告质粒+LncRNA MEG3空载质粒组、转染野生型miR-145-5p报告质粒+LncRNA MEG3过表达质粒组、转染突变型miR-145-5p报告质粒+LncRNA MEG3空载质粒组、转染突变型miR-145-5p报告质粒+LncRNA MEG3过表达质粒组、转染miR-145-5p无义序列+LncRNA MEG3空载质粒组、转染miR-145-5p无义序列+LncRNA MEG3过表达质粒组，以1.2.4中方法分组转染24 h后，收集各组细胞并用试剂盒检测双荧光素酶相对活性，具体操作遵照说明书指导步骤进行。
1.3　统计学方法　实验数据均为计量资料以均数±标准差表示，采用SPSS 24.0软件做统计学分析，对照组与模型组之间差异比较采用t检验；模型组与其余各组之间差异比较采用单因素方差分析，两两之间进一步比较行LSD-t检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　各组大鼠玻璃体中EB含量、视网膜血管内皮细胞凋亡率及房水中炎症因子IL-6、IL-1β含量　模型组大鼠玻璃体中EB含量、视网膜血管内皮细胞凋亡率及房水中IL-6、IL-1β含量均高于对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。LncRNA MEG3过表达组大鼠玻璃体中EB含量、视网膜血管内皮细胞凋亡率及房水中IL-6、IL-1β含量均低于模型组、共转染组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；miR-145-5p agomir组大鼠玻璃体中EB含量、视网膜血管内皮细胞凋亡率及房水中IL-6、IL-1β含量均高于模型组、共转染组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；共转染阴性对照组大鼠玻璃体中EB含量、视网膜血管内皮细胞凋亡率及房水中IL-6、IL-1β含量与模型组、共转染组相比，差异均无统计学意义（均为P>0.05）（图1和表2）。



2.2　各组HRMEC增殖率、凋亡率及炎症因子IL-6、IL-1β含量　模型组HRMEC增殖率低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；HRMEC凋亡率及IL-6、IL-1β含量均高于对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。LncRNA MEG3过表达组HRMEC增殖率均高于模型组、共转染组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；HRMEC凋亡率及IL-6、IL-1β含量均低于模型组、共转染组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；miR-145-5p agomir组HRMEC增殖率均低于模型组、共转染组，差异均有统计学意义（均为P<0.05），HRMEC凋亡率及IL-6、IL-1β含量均高于模型组、共转染组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；共转染阴性对照组HRMEC增殖率、凋亡率及IL-6、IL-1β含量与模型组、共转染组相比，差异均无统计学意义（均为P>0.05）（图2、图3和表3）。







2.3　各组HRMEC、大鼠视网膜组织miR-145-5p及凋亡相关蛋白表达情况　模型组HRMEC、大鼠视网膜组织miR-145-5p及Bax表达高于对照组，Bcl-2表达低于对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。LncRNA MEG3过表达组HRMEC、大鼠视网膜组织miR-145-5p及Bax表达均低于模型组、共转染组，Bcl-2表达均高于模型组、共转染组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；miR-145-5p agomir组HRMEC、大鼠视网膜组织miR-145-5p及Bax表达均高于模型组、共转染组，Bcl-2表达均低于模型组、共转染组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；共转染阴性对照组HRMEC、大鼠视网膜组织miR-145-5p及Bax、Bcl-2表达与模型组、共转染组相比，差异均无统计学意义（均为P>0.05）（图4和表4）。



2.4　HRMEC中LncRNA MEG3对miR-145-5p的靶向调节作用　通过在线预测软件targetscan发现LncRNA MEG3与miR-145-5p之间有结合位点（图5）。转染野生型miR-145-5p报告质粒+LncRNA MEG3过表达质粒组细胞相对荧光素酶活性（0.33±0.05）低于转染野生型miR-145-5p报告质粒+LncRNA MEG3空载质粒组（1.02±0.21），差异有统计学意义（P<0.05）；转染突变型miR-145-5p报告质粒+LncRNA MEG3空载质粒组细胞相对荧光素酶活性（0.98±0.14）与转染突变型miR-145-5p报告质粒+LncRNA MEG3过表达质粒组（1.01±0.22）相比，转染miR-145-5p无义序列+LncRNA MEG3空载质粒组细胞相对荧光素酶活性（0.99±0.16）与转染miR-145-5p无义序列+LncRNA MEG3过表达质粒组（1.03±0.24）相比，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。



3　讨论
DR是糖尿病引发的最常见眼部并发症，对患者日常工作和生活造成很大不便，防治DR是糖尿病与眼底病领域的研究热点^［12-13］。本实验通过腹腔注射链脲佐菌素建立大鼠DR模型，以25 mmol·L^-1葡萄糖诱导DR细胞模型，结果显示，链脲佐菌素可造成大鼠高血糖，促使炎症因子IL-6、IL-1β表达，引发炎症，导致视网膜血管内皮细胞凋亡，视网膜血管屏障功能受损，另外高糖可通过诱导炎症因子IL-6、IL-1β过表达而引发HRMEC细胞炎症，抑制其增殖，并促进其凋亡。这表明DR大鼠及细胞模型构建成功。
研究显示，LncRNA MEG3是介导DR发生发展的重要RNA分子，在DR患者血清中，LncRNA MEG3水平显著降低^［14］；过表达MEG3可抑制DR大鼠模型和细胞模型内皮间充质转化，缓解视网膜病变^［15］。本实验以LncRNA MEG3过表达质粒干预处理DR大鼠模型和细胞模型，可降低炎症因子IL-6、IL-1β表达，抑制炎症发生及进展，减轻高糖导致的HRMEC及大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡，修复DR大鼠视网膜血管屏障功能。这表明过表达LncRNA MEG3可抑制DR大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡，再次证实了其对DR可起到防治作用。
DR发病原因复杂，高糖引发的炎症是导致DR患者视网膜微血管内皮细胞凋亡的主要病理因素，减轻炎症、抑制视网膜血管内皮细胞凋亡是防治DR的重要手段^［16-17］。miR-145-5p可介导炎症因子诱导的炎症反应，抑制炎症因子表达，阻断炎症信号转导，显著减轻脂多糖引发的小胶质细胞炎症反应，从而改善继发性脊髓损伤^［18-19］，还可保护视网膜神经节细胞免受高糖诱导的炎症损伤^［8］。而LncRNA MEG3可通过靶向抑制miR-145-5p表达，影响结核杆菌感染的巨噬细胞的生物学活性^［20］，因而推测下调miR-145-5p表达可能是过表达MEG3治疗DR的分子机制。本研究以miR-145-5p agomir上调DR大鼠及细胞模型中miR-145-5p的表达，可增强炎症因子表达，放大炎症反应，促进HRMEC及视网膜血管内皮细胞凋亡，加重DR大鼠视网膜血管屏障功能损伤，而过表达LncRNA MEG3可靶向下调HRMEC中miR-145-5p表达，并抑制DR大鼠视网膜组织过表达miR-145-5p。另外，本实验结果显示，miR-145-5p agomir可减弱过表达LncRNA MEG3对炎症因子表达的抑制作用，拮抗对炎症的减轻功效，最终逆转过表达LncRNA MEG3对视网膜血管内皮细胞凋亡的改善作用。这表明miR-145-5p介导DR的发生发展过程，LncRNA MEG3可通过靶向下调miR-145-5p抑制炎症反应，从而减轻DR大鼠视网膜血管内皮细胞凋亡。
综上所述，LncRNA MEG3可靶向下调HRMEC中miR-145-5p表达，从而降低高糖引发的炎症因子表达，抑制视网膜组织炎症及视网膜血管内皮细胞凋亡，改善血管通透性，进而修复血-视网膜屏障功能。本研究为DR的防治提供了新的候选治疗靶点，为DR临床治疗策略的改进及发展提供了参考。