《眼科新进展》  2023年1期 7-12   出版日期：2023-01-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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miR-223-3p调控NLRP3炎症小体对自身免疫性葡萄膜炎大鼠M1/M2巨噬细胞极化平衡的影响


自身免疫性葡萄膜炎是一种眼睛血管层的炎症性非感染性疾病，可导致视功能严重受损甚至失明，占美国所有致盲疾病的10%~15%^［1］。虽然皮质类固醇是目前治疗葡萄膜炎的有效方法，但严重的不良反应以及副作用使其不适合长期治疗^［2］。因此，更好地认识自身免疫性葡萄膜炎的发病机制可以为自身免疫性葡萄膜炎的治疗提供新靶点。MicroRNAs (miRNAs) 是一类长度约为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，可在转录后下调蛋白表达。miRNAs在多种疾病中低表达，其中miR-223-3p 可参与如NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）炎症小体、核因子κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3 激酶/ 蛋白激酶(PI3K/AKT)和核糖体蛋白S6 激酶/低氧诱导因子-1(RPS6KB1/HIF-1α)等多种信号通路的调控影响疾病发展进程^［3］。miR-223-3p与NLRP3炎症小体之间存在密切联系，在多种炎症反应和自身免疫性疾病中发挥作用，但它们在自身免疫性葡萄膜炎中的作用尚不清楚。巨噬细胞在炎症和宿主防御中发挥重要作用，执行重要的组织特异性功能。巨噬细胞能够响应许多不同的刺激而改变其表型，这一过程称为激活^［4］。巨噬细胞的两种主要表型包括经典活化巨噬细胞 (M1) 的极化促炎表型和交替活化巨噬细胞 (M2) 的极化抗炎表型^［5］。巨噬细胞M1/M2极化的不平衡通常与各种疾病或炎症状况有关^［6］。影响巨噬细胞极化动态变化的因素很多，主要受体内微环境的影响。近年的研究发现，NLRP3炎症小体也可以通过介导巨噬细胞极化来促进炎症的进程。本研究拟通过探讨miR-223-3p调控NLRP3炎症小体对巨噬细胞极化的影响来阐释葡萄膜炎发生过程中巨噬细胞极化的变化规律，为临床设计以巨噬细胞为干预靶点治疗炎症性疾病的治疗策略提供理论基础。
1　材料与方法　
1.1　主要试剂与仪器　光感受器间维生素A结合蛋白(IRBP)(上海生工公司);结核分枝杆菌(TB)(Difco公司，美国);完全弗式佐剂(CFA)(Sigma公司，美国); miR-223-3p慢病毒（吉满生物科技，上海）；高纯度质粒抽提试剂盒（TIANGEN，北京）；报告基因检测试剂盒（吉满生物科技,上海）;大鼠组织单核细胞分离液试剂盒（Solarbio公司，北京）；藻红蛋白（PE）CD86（eBioscience公司，美国）；PE-CD206（圣克鲁斯生物技术有限公司，上海）；BCA蛋白定量试剂盒(碧云天公司，上海),NLRP3、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素10（IL-10）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒（江莱生物技术有限公司，上海）；RNA提取试剂盒(思科捷公司，济南);逆转录试剂盒(诺唯赞生物科技股份有限公司，南京);LightCycler 480实时荧光定量PCR(Q-PCR)仪(Roche公司，美国); 多功能酶标仪(Perkin-Elmer公司，美国);流式细胞仪(BD FACSVerse^TM流式细胞仪,美国)。
1.2　实验动物分组及处理　将48只健康Lewis雌性大鼠（鼠龄6~8周，体重160~180 g，Charles River维通利华公司，北京）随机分为正常对照（NC）组、实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）组和miR-223-3p慢病毒组，每组16只。EAU组和miR-223-3p慢病毒组大鼠腹部两侧、颈背部、两足底分别注射200 μL含IRBP、CFA和TB的乳糜液以诱导EAU模型，NC组大鼠在相同部位注射200 μL只含CFA、TB的混合液（无IRBP多肽），miR-223-3p慢病毒组大鼠双眼玻璃体内分别注射8 μL携带miR-223-3p的慢病毒。大鼠饲养于 24 ℃、相对湿度60%的环境中，并保持充足的食物和水，12 d后取材。
1.3　双荧光素酶表达报告系统检测miR-223-3p调控NLRP3基因　根据生物信息学预测miR-223-3p与NLRP3基因的结合位点的信息，将NLRP3基因的3’UTR序列及其突变体克隆到双荧光素酶报告基因载体中，构建野生型（WT）及突变型（MT）重组双荧光素酶报告质粒载体，采用PCR及基因测序方法鉴定载体是否构建成功。将构建好的野生型和突变型重组双荧光素酶报告载体，通过mimic（miR过表达）+NLRP3野生型，mimics NC（miR过表达阴性对照）+NLRP3野生型， mimic+NLRP3突变型，mimics NC+NLRP3突变型进行共转染，转染后48 h以空白细胞裂解液为对照，观察报告基因相对荧光值（RLU）变化，明确miR-223-3p对NLRP3的调控作用。
1.4　Q-PCR检测各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中miR-223-3p、NLRP3、诱导型一氧化氮合酶和精氨酸酶-1的基因表达水平　造模12 d后，分别取各组大鼠的眼、脾脏和淋巴结组织，经RNA提取和反转录后进行Q-PCR检测。U6为miR-223-3p的内参，GAPDH为NLRP3、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和精氨酸酶-1（Arg-1）的内参。U6反转录引物序列为5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’，miR-223-3p反转录引物序列为5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGGG-TA-3’。U6上游引物序列：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物序列：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’;miR-223-3p上游引物序列：5’-GCGCGTGTCAGTTTGTCAAA-3’，下游引物序列：5’-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’：GAPDH上游引物序列：5’-CACGGCAAGTTCAACGGCACAGT-3’，下游引物序列：5’-AGCGGAAGGGGCGGAGATGAT-3’：NLRP3上游引物序列：5’-TCTTTGCGGCTATGTACTATCTGC-3，下游引物序列:5’-CTTCTTGGCCTTGGCTTTCACTTC-3’;iNOS上游引物序列:5’-CTTCCGGGCAGCCTGTGAGACG-3’,下游引物序列：5’-ATCCCCAGGTGTTCCCCAGGTAGG-3’；Arg-1上游引物序列：5’-CGGCTTGCGAGATGTGG-3’，下游引物序列：5’-TAGCCGGGGTGAATACTGG-3’。Q-PCR反应条件设置为：95 ℃、5 min,反应循环1次；95 ℃、20 s,57 ℃、25 s,60 ℃、25 s,循环45次。每组实验重复扩增3次。Q-PCR实验结束后，以NC组为对照（1.00±0.00),通过E=2^-ΔΔCt 计算mRNA的相对表达水平。
1.5　ELISA检测各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中NLRP3、TNF-α、IL-10的蛋白表达水平　造模12 d后，取各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织，用组织剪剪碎并在液氮条件下研磨成粉末后，根据组织的重量，加入350~800 μL的RIPA裂解液和苯甲基磺酰氟（PMSF）混合液（RIPA∶PMSF=100∶1）使蛋白溶解，然后组织匀浆机低温条件下研磨5 min使蛋白充分裂解,超声波细胞粉碎机超声10 min,8000 r·min^-1离心10 min去除泡沫,收集上清液即可得到所需蛋白样品。BCA法检测各组大鼠以上各组织样品的蛋白浓度，ELISA试剂盒分别检测各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中NLRP3、TNF-α、IL-10的蛋白表达水平。每组实验重复三次，取平均值，并进行统计学分析。
1.6　流式细胞术检测各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中M1、M2巨噬细胞极化水平　造模12 d后，分别取各组大鼠的眼、脾脏和淋巴结组织，用1640细胞培养基充分研磨，经过滤、离心、分离后得到所需单核细胞悬液，转移至6孔板，每孔加15 μL双抗，放入37 ℃、含体积分数5％CO₂的培养箱中孵育4 h，胰蛋白酶消化后得到贴壁细胞（单核细胞）。首先用FITC-F4/80和APC-CD11b抗体进行细胞表面染色30 min，将细胞固定破膜1 h后，然后用PE-CD206和PE-CD86进行细胞内染色，流式清洗剂清洗细胞后离心，去上清，最后加入500 μL PBS将细胞重悬，经滤网过滤后将得到的细胞悬液置于流式管中，然后用流式细胞仪检测各组织中M1、M2型巨噬细胞极化水平及M1/M2巨噬细胞比例变化。
1.7　统计学分析　数据均用均值±标准差表示，采用SPSS 26.0统计软件进行统计学分析，组内比较采用单因素方差分析(ANOVA)，组间两两比较采用最小显著性差异(LSD-t)检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　双荧光素酶基因检测报告　与NC组相比，WT组miR-233-3p对NLRP3基因野生型有较明显的下调表达（P<0.01），但MT组对预测的靶基因位点进行突变后，突变型载体中的RLU值表达水平与NC组相比未发生显著改变(P>0.05)(图1)。因此，miR-223-3p可明显调控带有NLRP3基因片段 3’UTR 基因的表达，NLRP3为miR-223-3p调控的靶基因。



2.2　各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中miR-223-3p、NLRP3、Arg-1和iNOS的mRNA表达水平　Q-PCR检测结果显示，与NC组（均为1.00±0.00)相比，造模12 d后，EAU组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中miR-223-3p表达水平均显著降低，而NLRP3和iNOS的mRNA表达水平均显著升高，Arg-1的mRNA表达水平均显著降低（均为P<0.05）。与EAU组相比，造模12 d后，miR-223-3p慢病毒组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中NLRP3和iNOS的mRNA表达水平均降低，而Arg-1的mRNA表达水平均升高（均为P<0.05）（见表1）。
2.3　各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中NLRP3、TNF-α、IL-10的蛋白表达水平　ELISA检测结果显示，与NC组相比，造模12 d后,EAU组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中TNF-α和NLRP3的蛋白表达水平均升高，而IL-10的蛋白表达水平均降低（均为P<0.05）;与EAU组相比，造模12 d后，miR-223-3p慢病毒组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中TNF-α和NLRP3的蛋白表达水平均降低，而IL-10的蛋白表达水平均明显升高（均为P<0.05）（见表2）。



2.4　各组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中M1、M2型巨噬细胞极化水平　流式细胞仪检测结果显示（见图2、图3、表3），与NC组相比，造模12 d后，EAU组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中M1型巨噬细胞极化



水平均显著升高，而M2型巨噬细胞极化水平则均降低，M1/M2巨噬细胞比例均升高（均为P<0.05）;与EAU组相比，造模12 d后，miR-223-3p慢病毒组大鼠眼、脾脏和淋巴结组织中M1型巨噬细胞极化水平均降低，而M2型巨噬细胞极化水平均升高，M1/M2型巨噬细胞比例均恢复平衡（均为P<0.05）。



3　讨论
葡萄膜炎是临床常见、严重危害眼健康的常见疾病，眼睛血管层的炎症是葡萄膜炎最常见的病理学表现。最近，miRNAs 在自身免疫性疾病和炎症性疾病中的作用越来越受到关注^［7］。研究发现，miR-223-3p与多种炎症和免疫反应有关，可作为评估盆腔炎和阿尔茨海默病疾病严重程度的生物标志物^［8-9］。MiR-223-3p在巨噬细胞、血小板、肝细胞和心肌细胞等多种细胞中表达，并通过多个靶向基因调节细胞活动^［3］，在多种疾病发病期间的炎症或免疫反应中发挥重要作用。已知miR-223-3p参与调节多个关键信号通路，如NLRP3炎症小体、NF-κB、MAPK、PI3K/AKT、RPS6KB1/HIF-1α信号通路。NLRP3炎症小体是一种细胞溶质蛋白复合物，由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)和caspase-1组成^［10］，作为固有免疫的组分在免疫防御中发挥重要作用。有研究发现^［11］,miR-223-3p与NLRP3 的 3’非翻译区片段相互作用并抑制其表达,与多种自身炎症性疾病有关，这与我们的双荧光素酶表达报告系统的实验结果一致。miR-223-3p通过负调节急性和慢性肝损伤中NLRP3炎症小体的水平，使单核细胞、早期活化的巨噬细胞的浸润减少，从而防止炎症的发生^［12］。在一项动物研究中^［13］，miR-223-3p 抑制 NLRP3 炎症小体的表达，促进树突状细胞向耐受性树突状细胞极化并可以防止小鼠发生自身免疫性心肌炎。因此我们推测，miR-223-3p调控NLRP3炎症小体可能与葡萄膜炎的发生发展有关。本研究通过建立大鼠EAU模型发现造模12 d后，与NC组相比，EAU组大鼠体内miR-223-3p基因表达水平显著降低，而NLRP3的mRNA和蛋白表达水平升高，与FAU组相比，miR-223-3p慢病毒组NLRP3的mRNA和蛋白表达水平显著降低，提示miR-223-3p可以负向调控NLRP3炎症小体的表达从而影响葡萄膜炎炎症进程，与既往研究结果相符。
巨噬细胞是组织内稳态和炎症反应中的关键细胞，执行重要的组织特异性功能^［14］。巨噬细胞根据其所处环境表现出不同的表型，两种主要的表型包括M1 极化促炎表型和M2 极化抗炎表型。巨噬细胞的典型M1型是由脂多糖（LPS）、C反应蛋白（CRP）以及Th1型细胞因子引起的^［15］。而巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、Th2型细胞因子能够使巨噬细胞向替代途径M2型极化^［15］。M1型巨噬细胞的特点是能够分泌CD86、TNF-α、iNOS和白细胞介素-1β（IL-1β）等促炎因子来介导急性炎症反应^［16］。随着炎症的发展，M2型巨噬细胞分泌IL-10和转化生长因子β（TGF-β）等抗炎介质来对抗炎症、促进组织修复和血管生成，其特征在于CD206标记的表达和Arg-1的产生^［16-18］。近年的研究发现，NLRP3炎症小体也可以通过介导巨噬细胞极化来促进炎症的进程。有研究表明，氧化三甲胺（TMAO）通过NLRP3炎症小体的激活来增强M1型巨噬细胞的极化^［19］。为了验证EAU模型中NLRP3炎症小体对巨噬细胞极化的影响，本实验从mRNA、蛋白、细胞三个层面展开了研究发现，与NC组相比,造模后12 d的EAU大鼠各组织iNOS mRNA、 TNF-α蛋白和巨噬细胞表面CD86的表达水平升高，而Arg-1 mRNA、IL-10蛋白和巨噬细胞表面CD206的表达水平降低。MiR-223-3p慢病毒组NLRP3炎症小体表达水平降低从而逆转以上炎症性相关因子的表达水平，恢复M1/M2巨噬细胞极化平衡，提示NLRP3 炎症小体可能诱导M1型巨噬细胞的极化，并增加促炎细胞因子的分泌来影响葡萄膜炎的发展进程。与本研究机制相似的是，Zhang等^［20］发现，在牙周组织中，正畸力刺激的人牙周韧带细胞通过激活M1型巨噬细胞中的NLRP3炎症小体可促进M1型巨噬细胞极化，增加IL-1β的产生，从而启动RR（牙根吸收）的发生。Ye等^［21］发现，在大脑中动脉栓塞模型中用MCC950（NLRP3 炎症小体的选择性抑制剂）治疗3 d后，巨噬细胞从促炎M1型转化为组织修复抗炎M2型。另外IL-37也可以抑制M1型巨噬细胞中的NLRP3炎症小体的激活，将巨噬细胞的极化从促炎M1型转移到有益的抗炎M2型，从而治疗颞下颌关节炎症^［22］，与本研究结果一致，说明NLRP3炎症小体成分的激活对M1型巨噬细胞极化有很大的促进作用。
本研究首先通过双荧光素酶检测证实了NLRP3是miR-223-3p调控的靶基因，并且与NC组相比，EAU组大鼠 miR-223-3p 基因表达水平降低，与NLRP3 mRNA表达呈负相关，说明miR-223-3p可以通过负调控NLRP3影响炎症进程。其次，EAU组大鼠M1/M2比例失衡（升高），推测可能与NLRP3的表达密切相关。因此，我们向EAU大鼠玻璃体内注射miR-223-3p慢病毒，通过提高EAU大鼠体内miR-223-3p的表达水平来抑制NLRP3炎症小体的激活，发现M2型巨噬细胞极化水平和抗炎因子表达升高从而减轻炎症反应达到治疗葡萄膜炎的作用。总之，提高miR-223-3p的表达水平可降低NLRP3炎症小体的表达并使相关炎症信号通路受到抑制，可能是开发自身免疫性葡萄膜炎新型治疗的策略之一。