《眼科新进展》  2021年9期 826-830   出版日期：2021-09-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

---

miR-181a靶向沉默信息调节因子相关酶1在过氧化氢诱导的人小梁网细胞氧化应激中的调节作用


原发性开角型青光眼（POAG）是一种由多种因素诱发的致盲眼病^［1］。人眼中70%以上的房水引流是通过小梁网进行的，眼内房水排出受阻引发的眼压升高是POAG发病的主要原因之一^［2-3］。近年来研究表明，氧化应激损伤是导致青光眼患者小梁网细胞损伤、凋亡及功能异常的重要原因^［4］。miRNA是非编码RNA，能特异性识别靶基因的3’-非翻译区（3’-UTR），通过与靶基因完全或部分互补结合，导致靶基因的降解或抑制其翻译^［5］。多种miRNA在小梁网细胞的氧化应激损伤中发挥作用，参与青光眼的发生、发展^［6-7］。miR-181a是一种多功能miRNA，与白内障等眼部疾病进展过程中的氧化应激损伤过程密切相关^［8-9］，在小梁网细胞氧化应激损伤中研究尚少。本研究探讨miR-181a对人小梁网细胞（HTMCs）抗氧化应激能力的影响及其可能的作用机制，为青光眼的防治寻找潜在靶点。
1　材料与方法　
1.1　材料　HTMCs（中科院细胞库）；胎牛血清（FBS）（上海碧云天生物技术有限公司）；miR-181a抑制剂（miR-181a inhibitor）、miR-181a拟似物（miR-181a mimics）及miR-181a阴性对照（miR-181a NC）、沉默信息调节因子相关酶1（SIRT1）小干扰RNA（si-SIRT1）及其阴性对照（si-NC）（上海吉玛基因公司）；Lipofectamine^TM 2000、实时荧光定量PCR（qRT-PCR)试剂盒（美国Abcam公司）；二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯（DCFH-DA）活性氧(ROS)荧光探针、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）ELISA检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；双荧光素酶报告基因检测试剂盒（美国Genomeditech公司）；兔抗人SIRT1单抗（美国Santacruz公司）。
1.2　方法　
1.2.1　细胞复苏与培养　HTMCs复苏，重悬于含体积分数10%FBS的DEME培养基中，置于37 ℃、体积分数5%CO₂培养箱中培养，融合至80%时，2.5 g·L^-1胰蛋白酶消化，离心弃上清，重悬，继续培养。
1.2.2　MTT法检测细胞存活率　取对数生长期的HTMCs，随机分为空白组（0 μmol·L^-1 H₂O₂）、200 μmol·L^-1 H₂O₂组、400 μmol·L^-1 H₂O₂组、600 μmol·L^-1 H₂O₂组，按1×10⁵个·mL^-1接种于96孔板中培养24 h，分别加入相应浓度H₂O₂处理 HTMCs,24 h后每孔加入20 μL 50 g·L^-1 MTT溶液，孵育4 h，每孔加入150 μL DMSO，充分振荡10 min，酶标仪在490 nm处检测各孔光密度（D），计算细胞存活率（细胞存活率=D_不同浓度H₂O₂组/D_空白组×100%）。
1.2.3　qRT-PCR检测各组HTMCs中miR-181a mRNA表达　收集空白组、200 μmol·L^-1 H₂O₂组、400 μmol·L^-1 H₂O₂组、600 μmol·L^-1 H₂O₂组HTMCs，Trizol法提取总RNA，分析RNA浓度和纯度，逆转录cDNA，qRT-PCR检测miR-181a mRNA表达。反应体系包括：cDNA 2.0 μL，上下游引物各 0.5 μL，SYBR^?预混液10 μL，加双蒸水至总体积20.0 μL。其中miR-181a上游引物序列：5’-TGCTTGATTGCTTAGCTTAC-3’，下游引物序列：5’-TAGGCTTAGCTTAGCATGGC-3’；U6上游引物序列：5’-GCTGCTTAGGCTACCATCGT-3’，下游引物序列：5’-GTAGCTAACGATTCACCTGA-3’。反应条件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 20 s，70 ℃ 5 s，共40个循环。采用2^-△△Ct法计算miR-181a mRNA相对表达量。
1.2.4　Western blot检测各组HTMCs中SIRT1蛋白表达　收集空白组、200 μmol·L^-1 H₂O₂组、400 μmol·L^-1 H₂O₂组、600 μmol·L^-1 H₂O₂组HTMCs，RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，脱脂牛奶室温封闭2 h；加入SIRT1（1∶1000）一抗，4 ℃封闭过夜；加入二抗（1∶2000），室温封闭1 h；加入电化学发光液曝光。以β-actin为内参，使用Quantity One软件分析蛋白条带灰度值。
1.2.5　细胞转染　根据转染物不同，将HTMCs分为miR-181a inhibitor组（转染 miR-181a inhibitor）、miR-181a NC组（转染miR-181a NC）、miR-181a mimics 组（转染miR-181a mimics）、miR-181a inhibitor+si-SIRT1组（同时转染miR-181a inhibitor和si-SIRT1）、miR-181a inhibitor+si-NC组（同时转染miR-181a inhibitor和si-NC），使用Lipofectamine^TM 2000转染后，加入200 μmol·L^-1 H₂O₂于培养箱中继续培养24 h。
1.2.6　Annexin V FITC/PI联合流式细胞仪检测HTMCs凋亡　取miR-181a inhibitor组、miR-181a NC组和miR-181a mimics组HTMCs，转染24 h后，胰蛋白酶消化，PBS洗涤，200 μL Binding Buffer重悬，加入5 μL Annexin V FITC和5 μL 碘化丙啶（PI）染液，避光反应15 min，1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。重复3次取均值。取miR-181a inhibitor+si-SIRT1组和miR-181a inhibitor+si-NC组细胞，转染24 h后，检测各组细胞凋亡率。重复3次取均值。
1.2.7　各组细胞中ROS含量检测　取miR-181a inhibitor组、miR-181a NC组和miR-181a mimics组HTMCs，转染24 h后，每孔加入200 μL DCFH-DA，静置30 min，PBS洗涤，收集各组细胞，酶标仪检测荧光值（激发波长488 nm、发射波长525 nm）；倒置显微镜下观察2’，7’-二氯荧光素（DCF）荧光，荧光越强代表ROS活性越高。每组设5个复孔。取miR-181a inhibitor+si-SIRT1组和miR-181a inhibitor+si-NC组细胞，转染24 h后收集细胞，HTMCs检测各组细胞ROS含量。每组设5个复孔。
1.2.8　SOD、MDA活性的检测　取miR-181a inhibitor组、miR-181a NC组和miR-181a mimics组HTMCs，转染24 h后，1000 r·min^-1离心5 min，收集上清，加入SOD、MDA抗体和酶标抗体，洗涤后加入底物显色液避光染色10 min，终止反应后，使用酶标仪于450 nm处测量D，根据标准曲线计算样品中SOD和MDA活性。每组设5个复孔。
取miR-181a inhibitor+si-SIRT1组和miR-181a inhibitor+si-NC组HTMCs，转染24 h后，收集细胞，离心检测各组细胞SOD、MDA活性，方法同上。每组设5个复孔。
1.2.9　miR-181a靶基因预测及双荧光素酶报告基因分析　将对数期细胞以每孔2×10⁵个接种于24孔板，用Lipofectamine^TM 2000将荧光素酶报告载体（SIRT1-3’-UTR-WT或SIRT1-3’UTR-MT）与miR-181a NC/inhibitor/mimics共转染细胞，以海肾荧光素酶质粒（每孔100 ng）为对照，与载体共转染。细胞转染24 h，用双荧光素酶报告分析系统测定荧光素酶活性。
1.3　统计学分析　采用SPSS 21.0软件对数据统计分析。计量资料以均数±标准差（x?±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　H₂O₂对HTMCs存活率的影响　MTT法检测结果显示，与空白组比较，200 μmol·L^-1 H₂O₂组、400 μmol·L^-1 H₂O₂组、600 μmol·L^-1 H₂O₂组细胞存活率均降低（均为P<0.05）；随着H₂O₂浓度增加，细胞存活率逐渐降低（均为P<0.05），呈现剂量依赖性。其中200 μmol·L^-1 H₂O₂组处理细胞后存活率接近半数抑制率，故后续实验选取H₂O₂的浓度为200 μmol·L^-1（见图1）。
2.2　H₂O₂对HTMCs miR-181a mRNA和SIRT1蛋白表达的影响　与空白组比较，200 μmol·L^-1 H₂O₂组、400 μmol·L^-1 H₂O₂组、600 μmol·L^-1 H₂O₂组HTMCs miR-181a mRNA的表达均升高，SIRT1蛋白的表达均降低（均为P<0.05）；miR-181a mRNA的表达随着H₂O₂浓度的增加而升高，SIRT1蛋白的表达随着H₂O₂浓度的增加而降低（均为P<0.05）（见图2、表1）。
2.3　miR-181a对HTMCs凋亡的影响　miR-181a NC组、miR-181a mimics组和miR-181a inhibitor组细胞凋亡率分别为（16.6±1.85）%、（34.65±2.66）%和（10.05±1.02）%，3组间比较差异有统计学意义（F=6.424，P<0.001）。两两比较结果显示，miR-181a mimics组细胞凋亡率高于miR-181a NC组（P<0.05），miR-181a inhibitor组细胞凋亡率低于miR-181a NC组（P<0.05）。







2.4　miR-181a对HTMCs各氧化应激指标表达的影响　miR-181a NC组、miR-181a mimics组和miR-181a inhibitor组间细胞SOD活性、MDA活性和ROS含量比较，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。两两比较结果显示，miR-181a mimics组细胞SOD活性低于miR-181a NC组，MDA活性和ROS含量均高于miR-181a NC组（均为P<0.05）；miR-181a inhibitor组细胞SOD活性高于miR-181a NC组，MDA活性和ROS含量均低于miR-181a NC组（均为P<0.05）（见表2）。



2.5　miR-181a靶基因预测结果　miR-181a靶基因预测结果显示，miR-181a与SIRT1保守位点有高度结合，SIRT1为miR-15a的一个潜在作用靶点。双荧光素酶报告分析结果显示，miR-181a inhibitor组细胞SIRT1-3’-UTR-WT报告基因的荧光素酶活性高于miR-181a NC组（P<0.05），miR-181a mimics组细胞SIRT1-3’-UTR-WT报告基因的荧光素酶活性低于miR-181a NC组（P<0.05），转染突变载体的细胞内未观察到明显的荧光素酶活性改变，表明SIRT1是miR-181a的直接靶向蛋白。miR-181a inhibitor 组细胞内SIRT1蛋白相对表达量均高于miR-181a NC组和miR-181a mimics组（均为P<0.05），miR-181a mimics组细胞内SIRT1蛋白相对表达量低于miR-181a NC组（P<0.05）（见图3）。



2.6　干预SIRT1表达对miR-181a inhibitor组HTMCs凋亡率的影响　miR-181a inhibitor+si-SIRT1组细胞凋亡率为（45.24±5.73）%，显著高于miR-181a inhibitor+si-NC组［（16.32±1.03）%］（P<0.05）。
2.7　干预SIRT1表达对miR-181a inhibitor组HTMCs各氧化应激指标表达水平的影响　miR-181a inhibitor+si-NC组细胞SOD活性高于miR-181a inhibitor+si-SIRT1组，MDA活性和ROS含量均低于miR-181a inhibitor+si-SIRT1组（均为P<0.05）（见表3）。



3　讨论
正常情况下，机体利用抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶等和抗氧化剂谷胱甘肽及微量元素等清除体内ROS。若ROS生成增多或清除减少，则可发生氧化应激反应^［10-11］。小梁网是房水流出通道及眼压调节的主要部位，其形态、体积、收缩特性及其与细胞外基质的相互作用决定了房水外流程度和眼压高低。青光眼眼压增高与小梁网氧化变性过程有关。本研究应用H₂O₂建立HTMCs氧化应激模型，探讨其发生发展机制，旨在指导临床治疗青光眼。
miR-181a能通过多个靶向基因，调控细胞的生物学活动。王超等^［12］研究证实，敲除miR-181a能够逆转由氧化应激诱导的HLE-B3细胞凋亡。另有研究显示，白内障患者晶状体上皮细胞中miR-181a高表达，SIRT1低表达，miR-181a可调控人晶状体上皮细胞中SIRT1表达，从而影响年龄相关性白内障的发病^［13］。但有关miR-181a在青光眼中的作用的报道尚少，因青光眼和白内障都是与氧化应激损伤密切相关的疾病，因此，本研究探讨miR-181a是否对HTMCs的氧化应激损伤有调控作用。
本研究结果表明，氧化应激条件下，HTMCs中miR-181a mRNA相对表达量增加，抑制miR-181a mRNA表达后，HTMCs凋亡率降低，上调其表达后，HTMCs凋亡率升高，同时，与miR-181a NC组比较，miR-181a inhibitor组细胞SOD活性升高，MAD活性和ROS含量降低，提示在氧化应激条件下，miR-181a能刺激HTMCs凋亡，抑制HTMCs的抗氧化应激能力。
SIRT1是细胞代谢辅酶NAD+依赖的Ⅲ类组蛋白去乙酰化酶，Ren等^［14］研究发现，青光眼HTMCs中SIRT1表达低于正常HTMCs，转染SIRT1后受损细胞修复能力增强，细胞衰老延缓，证明SIRT1具有抗氧化应激作用。另有研究发现，POAG患者小梁网组织中SIRT1表达水平降低，可能在线粒体功能失调和氧化应激对小梁网的损伤中发挥重要调控作用^［15］。本研究结果发现，氧化应激条件下HTMCs中SIRT1表达降低，说明SIRT1可能参与HTMCs氧化应激调控，且调控结果同miR-181a相反。转染miR-181a inhibitor的HTMCs中SIRT1表达上调，而转染miR-181a mimics的HTMCs中SIRT1表达被抑制，表明miR-181a可能参与调控SIRT1表达。本研究进一步经双荧光素酶报告基因实验检测miR-181a与SIRT1的靶向关系，结果证实SIRT1是miR-181a的靶基因，且最终通过转染si-SIRT1，证明了这一通路在高糖诱导的HTMCs氧化应激损伤中的作用。
综上，本研究结果表明，miR-181a通过调节SIRT1在H₂O₂诱导的HTMCs氧化应激中发挥重要调控作用，对该机制的进一步研究可能有助于开发新的白内障的治疗靶点。