《眼科新进展》  2021年9期 821-825   出版日期：2021-09-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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重力打击式小鼠外伤性视神经病变模型的建立及外伤性视神经病变发病机制的探讨


外伤性视神经病变是指由于颅脑损伤、面部骨折等所引起的视神经病变，患者出现急性视功能下降，其中43%~56%的患者视功能下降严重，多为间接性损伤^［1-2］。研究表明，外伤后视神经出现的局部缺血、炎症、氧化应激、细胞凋亡等与视网膜神经节细胞的死亡以及视神经的萎缩相关^［3］，但具体致病机制不明。近年来，炎症在外伤性颅脑损伤中的作用备受重视，白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α作为炎症过程中的主要促炎症因子，可在伤后形成细胞因子风暴并对组织造成进一步损伤。研究发现，小鼠颅脑外伤后IL-1β、TNF-α在脑组织的表达增高，通过注射IL-1β抗体、TNF-α抑制剂可有效减少小鼠脑组织中神经元细胞的缺失并能提高小鼠的认知能力^［4-5］。本研究通过建立小鼠重力打击式的外伤性视神经病变的动物模型，观察外伤性视神经病变小鼠视网膜中IL-1β、TNF-α表达的变化情况，为进一步研究IL-1β、TNF-α在外伤性视神经病变发病机制中的作用提供理论依据。
1　材料与方法　
1.1　实验动物与分组　选取SPF级C57BL/6J成熟小鼠48只（96眼），体重21~28 g，雌雄不限。实验小鼠购自中山大学中山眼科中心动物实验中心。均取小鼠左眼为实验眼进行造模，右眼为对照眼不做处理。外伤造模后第1、3、5、7天对小鼠进行观察，每个时间点取6只小鼠进行闪光视觉诱发电位(F-VEP) 检查、视网膜组织HE染色，另取6只小鼠进行RT-PCR检测。入组前均对小鼠进行眼部筛查，排除白内障、角膜疾病、视网膜脱离等常见眼病。本研究经中山大学中山眼科中心实验动物伦理委员会审核通过（编号：2012-081）。
1.2　主要实验仪器与试剂　本研究所用打击锤为定制钢制打击锤，质量为30 g，锤身呈圆柱体，打击锤头部近似圆锥体，椎体的尖端与小鼠角膜接触，直径为3 mm，打击锤另一端固定有圆环（广州华光不锈钢五金部）。视觉电生理仪RETI-Port/Scan21（德国罗兰公司）,PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time试剂盒、SYBR Premix Ex Taq试剂盒（日本Takara公司），激光扫描共聚焦显微镜（德国Zeiss公司），荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。
1.3　外伤性视神经病变动物模型的建立　以43 g·L^-1水合氯醛按照 1 mL·g^-1的剂量经小鼠腹腔进行注射麻醉；架设铁架台，保持透明聚氯乙烯硬管垂直于水平面，固定牢固，防止在造模过程中摆动；将麻醉后的小鼠头部放置于塑料泡沫的凹陷处，保持其眼眶位置水平，角膜朝上，将透明聚氯乙烯硬管垂直放置于小鼠眼部，角膜顶点位于管中央，将打击锤放入管内，从15 cm高处沿导管垂直落下打击角膜中央，重复2次。
1.4　F-VEP检查和视网膜组织HE染色　让小鼠暗适应30 min，然后以43 g·L^-1水合氯醛按照1 mL·g^-1的剂量经小鼠腹腔进行注射麻醉。仪器刺激模式定为Ganzfeld Q400，刺激频率为2 Hz，通频带为1~100 Hz，刺激强度为0 db，分析时间250 ms，叠加次数为64。完全遮盖小鼠对侧眼，将小鼠固定于平板上，保持检测眼直视前方，尽量保持记录电极与身体长轴平行；将参考电极置于鼻部，接地电极置于尾部皮下。每眼重复3次检查。颈椎错位法处死小鼠后取眼球制作石蜡切片，HE染色后在显微镜下进行观察。
1.5　RT-PCR检测小鼠视网膜中IL-1β、TNF-α基因的表达　取小鼠新鲜视网膜组织，放入Trizol中保存。按试剂盒说明书操作步骤提取总RNA，测定总RNA浓度，逆转录cDNA，采用RT-PCR进行基因扩增。引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。TNF-α上游引物序列为5’-CACCACCATCAAGGACTCAAAT-3’，下游引物序列为5’-TCAGGGAAGAATCTGGAAAGGT-3’；IL-1β上游引物序列为5’-GAAAGCTCTCCACCTCAATG-3’，下游引物序列为5’-GCCGTCTTTCATTACACAGG-3’；内参GAPDH上游引物序列为5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物序列为5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。采用2^-ΔΔCt法计算基因相对表达量。
1.6　统计学方法　采用SPSS 22.0软件进行数据分析。正态分布的计量资料采用均数±标准差进行描述。不同组别和不同时间检查结果采用双因素方差分析，两因素之间存在交互作用时，采用简单主效应和成对比较分析。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　造模后小鼠基本情况观察结果　造模后小鼠实验眼出现瞳孔散大或相对性传入性瞳孔功能障碍，未出现眼球破裂，眼内出血，视网膜脱离等眼部明显损伤改变；对照眼无明显改变。所有小鼠均无明显颅脑损伤，活动能力均可，体重无明显下降。
2.2　F-VEP检查结果　F-VEP检查结果显示，小鼠对照眼和实验眼均能检测出明显的负向波形，本实验命名为N1波。在造模后第1、3、5、7天，小鼠实验眼F-VEP 振幅均显著低于对照眼，差异均有统计学意义（均为P<0.001）（见图1和表1）。







2.3　HE染色结果　造模后小鼠对照眼的视网膜结构层次清晰，视网膜神经节细胞呈单层排列，排列整齐密集，胞核清楚，核膜光滑完整。小鼠实验眼造模后视网膜轻度增厚，视网膜神经节细胞层可见细胞间空泡形成，视网膜神经节细胞排列出现紊乱，在造模后第7天可见神经节细胞核出现缺失（见图2）。
2.4　小鼠对照眼和实验眼视网膜中IL-1β和 TNF-α mRNA的表达情况　造模后第1、3、5、7天小鼠实验眼视网膜中IL-1β和TNF-α mRNA相对表达量均明显低于对照眼（均为P<0.05）；小鼠对照眼和实验眼视网膜中IL-1β和TNF-α mRNA相对表达量均随时间进展呈下降趋势（均为P<0.05）（见表2）。







3　讨论
外伤性视神经病变是一种急性视神经损伤，受伤原因包括交通事故、头部创伤、攻击伤、刺伤、枪伤、内窥镜鼻窦手术事故等，可对视功能造成严重损害。目前临床上对该病主要的治疗方案为皮质类固醇治疗和视神经管减压手术，但两者疗效均存在争议^［2］。为了明确治疗方向，人们对外伤性视神经病变的发病机制进行深入细致的研究，也建立了各种动物模型。目前主要有5种致伤模型，包括对视神经的直接剪切、夹持、撞击，利用超声波对上眶缘进行冲击以及对眼球进行钝性打击^［6-10］。前3种方法主要是对视神经造成直接损伤，虽然损伤明确，但均为侵入性损伤，且受伤方式在临床上并不常见，后两种为非侵入性损伤，受伤方式与临床相似，更适合模拟临床病例。在超声波制作的动物模型中，因其自身的特点容易使力量分散，造成对侧眼受损，这点在体积小的动物身上表现得尤其明显，这样就无法使用对侧眼作为对照，使用的实验动物数量将大大增加，并且该模型对于超声设备有特殊的要求，使用上并不便利。
本实验参考了改良的Allen重击法，用打击锤在垂直导管中利用重力从距离小鼠眼表平面15 cm高度落下对小鼠眼球进行垂直打击造成损伤^［11］，打击力可量化并且可以通过高度进行调节。虽然需要在预实验阶段调节打击力以防止出现眼球前后节明显的损伤（如出血），但整体上是一个操作简便的模型。小鼠因其基因与人类高度相似^［12］、价格低廉、获取便利、生长周期短等特点被广泛应用于生物医学实验中^［13］，已成为最受欢迎的实验动物^［14］。目前，尚未见以小鼠为实验动物建立重力打击式眼外伤模型的报道，本实验拟进行尝试。
VEP能记录从视网膜至视皮层的视觉刺激的脑电波，可以客观反映视功能的状况，主要分为图形和闪光两种形式，其中F-VEP更适用于视力较差或是配合不佳的检查对象^［15］。外伤性视神经病变患者的视力大多严重受损，部分颅脑损伤患者处在半昏迷状态，F-VEP是检查视功能最佳的选择。F-VEP检查的结果由主波的潜伏期和振幅组成。研究表明，外伤后当F-VEP的振幅低于正常的50%或者更多时，伤眼最佳矫正视力不会超过0.06，当振幅是正常的50%以上时，伤眼最佳矫正视力可达0.6^［16］。由此可见，振幅是判断伤后视力预后的重要指标。另有研究表明，小鼠视神经受损后经F-VEP检查呈现负向主波且振幅较受伤前显著下降^［17］，这与本研究结果一致。视神经是由视网膜神经节细胞的轴索所构成，当视神经发生损伤时神经节细胞无法自行再生其轴索，有95%的视网膜神经节细胞最终会因为逆行性退化而死亡^［18］。通过HE染色可发现伤后早期视网膜水肿，神经节细胞核排列紊乱，约2周后可见神经节细胞核缺失^［19］。本研究HE染色早期结果与此相似，但在第7天时即发现部分神经节细胞核丢失，提示不同模型之间存在差异。以上F-VEP和HE染色结果均表明，本实验已成功造成小鼠实验眼出现视神经损伤并引起了视网膜神经节细胞的改变。
炎症是机体对于感染或是外伤的一种适应性反应，当炎症反应调节失衡时产生大量的促炎症因子，形成“细胞因子风暴”，最终导致组织破坏及细胞死亡^［20］，对机体造成损伤^［21］。IL-1β、TNF-α就是最为主要的两种促炎症因子。IL-1β由活化的巨噬细胞产生，其主要功能是诱导中性粒细胞活化，调节其他炎症因子，例如IL-2、 IL-6、 IL-8、γ-干扰素的生成，调节有丝分裂，刺激吞噬，诱导发热、血管生成和程序性细胞死亡^［22］。颅脑外伤相关研究证明，IL-1β的高度表达会对脑组织造成进一步的破坏^［23］。反之，当外伤后IL-1β转化酶不足或是使用了IL-1β拮抗剂后则可以减轻脑组织的损伤^［24-25］。TNF-α由小胶质细胞、巨噬细胞产生，通过与其受体1和受体2结合发挥多种作用，包括免疫刺激、抗感染、恶性细胞毒性、睡眠调节、胚胎发育等。当颅脑外伤时，TNF-α参与协调产生促炎症因子的级联反应，激活脂质信号转导介质，通过细胞因子和IL信号通路增强机体的炎症状态^［26］。实验证明，兔颅脑外伤后使用TNF-α阻滞剂依那西普可有效降低TNF-α的水平，减少局部缺血，抑制神经元细胞以及神经胶质的凋亡。以上研究提示，IL-1β、TNF-α可以成为临床上颅脑损伤的治疗靶点。视神经作为中枢神经系统的一部分，我们有理由假设IL-1β、TNF-α也在外伤性视神经病变中发挥着重要的作用。本实验中，外伤后小鼠实验眼视网膜中IL-1β、TNF-α的表达明显高于对照眼，初步证实了该假设。
综上所述，本次我们成功建立了小鼠重力打击式外伤性视神经病变模型，造模后实验眼视网膜中IL-1β、TNF-α均呈高表达，提示IL-1β、TNF-α在外伤性视神经病变的发病机制中发挥了重要作用。