《眼科新进展》 2021年9期
812-816
出版日期：2021-09-05
ISSN:1003-5141
CN:41-1105/R
驻景丸加减方对干性年龄相关性黄斑变性模型小鼠视网膜的保护作用
年龄相关性黄斑变性(AMD)是老年人主要致盲性眼病之一。临床上，依据脉络膜新生血管的有无将AMD分为干性和湿性两类。湿性AMD的治疗由于抗血管内皮生长因子药物的广泛应用取得了显著疗效［1］，而干性AMD迄今尚无确切有效的治疗措施。
驻景丸加减方源自近代眼科专家陈达夫所著《中医眼科六经法要》［2］，是治疗肝肾亏虚内障眼病的代表方剂，用于治疗肝肾不足引起的多种眼疾，如糖尿病视网膜病变、原发性视网膜色素变性等［3］。驻景丸加减方治疗干性AMD取得了良好的临床效果［4］，但其作用机制尚不清楚。有研究报道，核因子E2相关因子2 (Nrf2)通路和自噬参与了干性AMD的发病过程［5］。本研究探讨驻景丸加减方对干性AMD模型小鼠视网膜的保护作用以及对Nrf2通路和自噬的影响，旨在探明其作用机制，为临床推广应用提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物及分组 取6月龄健康雄性C57BL/6小鼠90只，体重27~32 g，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供。将小鼠随机分为：年龄对照组(正常饮食)、溶媒对照组(高脂饮食+氢醌)、对照药物组(高脂饮食+氢醌+莱视盯)及中药组(高脂饮食+氢醌+驻景丸加减方，分低、中、高三个剂量组)6组，每组15只。本研究动物处理遵循《实验动物管理条例》（2017修订版）的规定。
1.1.2 药物 驻景丸加减方处方：楮实子、菟丝子、枸杞子、茺蔚子、木瓜、车前子、五味子、紫河车粉、寒水石、生三七，药物为颗粒剂，购于江阴天江药业有限公司。对照药为莱视盯(国食健字G20150015)，由湖北思维康生物工程有限公司生产（规格为每粒0.35 g）。莱视盯主要成分：叶黄素、β-胡萝卜素、葡萄糖酸锌，每100 g含叶黄素 2.20 g、β-胡萝卜素 0.86 g、锌 1.50 g。
1.1.3 主要试剂及仪器 氢醌购自英国Alfa Aesar公司，活性氧自由基（ROS）、丙二醛（MDA）试剂盒购自南京建成生物研究所，Nrf2、血红素加氧酶-1 (HO-1)、醌氧化还原酶-1(NQO-1)、p62一抗购自英国Abcam公司，LC3一抗购自美国Cell Signaling Technology公司，IgG/HRP二抗购自英国Abcam公司。酶标仪(美国Synergy公司)，电泳仪、凝胶成像仪(美国Bio-RAD公司)，超薄切片机(美国Power Tome XL公司)，透射电镜(美国FEI公司)。
1.2 方法
1.2.1 动物造模及给药方法 采用高脂肪饮食喂养C57BL/6小鼠3个月后，饮水中加入氢醌至终浓度为8 g·L-1，继续饲养3个月完成造模。驻景丸加减方颗粒剂低、中、高剂量对应生药量分别为：0.165 g·kg-1、0.330 g·kg-1、0.660 g·kg-1，莱视盯给药量为0.1 g·kg-1。将药物用蒸馏水溶解后灌胃，每天1次，持续3个月。
1.2.2 透射电镜观察 观察期满各组随机取5只小鼠处死，摘取眼球，用25 g·L-1戊二醛固定24 h，沿视盘两侧切取2 mm×4 mm大小球壁，10 g·L-1的锇酸固定，用磷酸缓冲液冲洗，梯度丙酮脱水，环氧丙烷树脂浸透包埋，半薄定位后制作超薄切片，柠檬酸铅避光染色。采用透射电镜观察视网膜超微结构、摄片。小鼠视网膜色素上皮 (RPE)下沉积物面积采用ImageJ软件计算，Bruch膜厚度从图片直接测定。
1.2.3 ROS、MDA含量测定 观察期满各组随机取5只小鼠处死，提取视网膜，将小鼠视网膜组织匀浆，3000 r·min-1、4 ℃离心10 min，取上清液用于检测。ROS含量检测用DCFH-DA法，MDA含量检测用TBA比色法，按照试剂盒说明书进行操作。
1.2.4 Western blot检测蛋白表达 各组将剩余5只小鼠处死，提取视网膜、脉络膜，将视网膜、脉络膜组织匀浆后提取蛋白(Nrf2另提取核蛋白)， 采用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白变性后取50 μg上样，电泳、转膜后加一抗(1∶1000) 4 ℃孵育过夜，再加兔二抗(1∶5000)，β-actin为内参(核蛋白内参为Lamin B)，加入化学发光剂显影后，采用ImageJ软件进行条带灰度值分析。
1.3 统计学分析 本研究数据采用GraphPad Prism 7软件进行分析。数据以均数±标准差表示，采用单因素方差分析进行组间比较。检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 各组小鼠透射电镜下视网膜超微结构 各组小鼠透射电镜下视网膜超微结构见图1。年龄对照组小鼠Bruch膜厚度基本正常，RPE下沉积物较少；与年龄对照组相比，溶媒对照组RPE下沉积物面积显著增大、Bruch膜明显增厚，差异均有统计学意义(均为P<0.01)。与溶媒对照组相比，中药中、高剂量组RPE下沉积物面积减小、Bruch膜厚度变薄，差异均有统计学意义(均为P<0.01)；与溶媒对照组相比，中药低剂量组和对照药物组RPE下沉积物面积也均减小，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，但Bruch膜厚度变化不明显（见表1）。
2.2 各组小鼠视网膜ROS、MDA含量 各组小鼠视网膜ROS、MDA含量检测结果见表2。与年龄对照组相比，溶媒对照组ROS、MDA含量明显升高，差异均有统计学意义(均为P<0.01)；与溶媒对照组相比，中药中、高剂量组ROS、MDA含量均显著降低(均为P<0.01)，中药低剂量组和对照药物组ROS、MDA含量也均降低 (均为P<0.05)。
2.3 Western blot检测结果
2.3.1 各组小鼠视网膜细胞质、细胞核Nrf2蛋白表达情况 各组小鼠视网膜细胞质、细胞核Nrf2蛋白表达结果见图2。与年龄对照组相比，溶媒对照组Nrf2蛋白在细胞质表达下调、细胞核表达上调 (均为P<0.05)；与溶媒对照组相比，中药中、高剂量组细胞质中Nrf2蛋白表达均显著下调，细胞核Nrf2蛋白表达均上调(均为P<0.01)，中药低剂量组和对照药物组细胞质Nrf2蛋白表达下调，细胞核Nrf2蛋白表达上调 (均为P<0.05)（见表3）。
2.3.2 各组小鼠视网膜HO-1、NQO-1、p62和LC3 II蛋白表达情况 各组小鼠视网膜HO-1、NQO-1、p62和LC3 II蛋白表达结果见图3。与年龄对照组相比，溶媒对照组HO-1、LC3 II蛋白表达均上调 (均为P<0.05)；与溶媒对照组相比，中药中、高剂量组HO-1、NQO-1、p62和LC3 II蛋白表达均显著上调(均为P<0.01)，中药低剂量组HO-1、p62和LC3 II 蛋白表达均上调(均为P<0.05)，对照药物组HO-1和LC3 II蛋白表达均上调 (均为P<0.05)（见表4）。
3 讨论
大量研究表明，氧化损伤是AMD发病的关键始动因素，抗氧化治疗是防治干性AMD的主要研究方向。研究证实，药理剂量的抗氧化剂(含β-胡萝卜素、维生素C和维生素E等)可阻止中、晚期AMD的进展［6］。抗氧化维生素已被纳入了中国干性AMD治疗路径［7］。
驻景丸加减方是临床治疗干性AMD的有效方剂。本研究结果显示，驻景丸加减方能显著减少RPE下沉积物面积、抑制Bruch膜增厚，表明驻景丸加减方对干性AMD模型小鼠视网膜有保护作用。Nrf2通路是人体重要的抗氧化防御性通路，在AMD的发病过程中起到重要作用。Nrf2敲除小鼠视网膜出现了AMD样病理性改变［8］，激活Nrf2通路对氧化损伤的ARPE-19细胞和干性AMD模型动物视网膜有保护作用［9-10］。现代药理学证实，子类中药多数有很强的抗氧化作用［11-12］，木瓜、山楂、三七的活性成分也有抗氧化作用［13-15］，这些饮片都存在于驻景丸加减方中。人眼黄斑长时间接受光照，产生大量ROS。ROS可氧化Keapl上的半胱氨酸残基，促进Nrf2从Keapl上解离，Nrf2进入细胞核内，与抗氧化反应元件结合，启动抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶等基因的转录和翻译，增强细胞清除ROS的能力［16］。
本研究结果显示，驻景丸加减方下调细胞质中Nrf2蛋白表达，上调细胞核中Nrf2蛋白表达，上调HO-1、NQO-1蛋白表达，减少ROS、MDA含量。研究表明，驻景丸加减方可促进Nrf2核转位，启动下游靶蛋白HO-1、NQO-1表达，增强抗氧化能力，减少视网膜ROS、MDA含量，从而起到保护AMD模型小鼠视网膜的作用。本研究采用的对照药物也有促进Nrf2核转位、上调HO-1蛋白表达和减少视网膜中ROS、MDA含量的作用，这与相关文献报道结果一致［17］。
自噬在RPE细胞稳态中起着至关重要的作用，与AMD发病密切相关［18］。ROS是自噬重要的诱导剂［19］，抗氧化药物可减少ROS生成、增强自噬，对ARPE-19细胞起保护作用［20］。本研究结果显示，驻景丸加减方可上调自噬调节蛋白p62和激活标志蛋白LC3 II的表达，表明驻景丸加减方可增强自噬，加快清除氧化损伤的细胞器，从而减轻AMD模型小鼠视网膜进一步损伤。
综上所述，驻景丸加减方可激活Nrf2通路，上调下游靶基因酶HO-1、NQO-1表达，快速清除ROS、MDA；并可增强自噬，加快清除氧化损伤的细胞器。本研究证实，驻景丸加减方对干性AMD模型小鼠视网膜有保护作用。