《眼科新进展》  2021年7期 692-695   出版日期:2021-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
靶向治疗视网膜疾病的研究进展


遗传性视网膜疾病(IRD)是一组影响视网膜基因型和表型的致盲性眼病[1]。视网膜神经感觉层是一种薄的多层结构,由多种细胞构成(光感受器、双极细胞、视网膜神经节细胞及各种中间神经元亚型)[2]。视网膜周边富含视杆细胞,对周边视觉和微光视觉有重要作用。黄斑中心凹富含视锥细胞,对于视敏度和色觉处理非常重要[3]。与之外层相邻的视网膜色素上皮(RPE)层对这些感光细胞的功能至关重要。许多IRD的病理生理表现被认为是由于RPE层、视杆细胞、视锥细胞的功能障碍引起的。IRD在所有年龄段的视力损害中都占有一席之地,其主要影响双侧和对称的视网膜,也有感觉神经性耳聋、肾病等眼外表现。临床诊断主要依靠临床检查和辅助诊断试验,包括光学相干断层扫描(OCT)、眼底自发荧光、视网膜电图(ERG)和视野检查。然而,鉴于IRD的异质性遗传特性[4]和当前治疗方式的特异性,基因检测已成为诊断的基本手段。1 视网膜营养不良的分子诊断试验 
新一代测序技术(NGS)的发展改变了分子诊断学领域,使快速、高通量、全基因组和全外显子组测序成本大幅降低。由此可对已知的视网膜营养不良基因和候选基因进行靶向分析,并极大提高了诊断效率和准确性,但传统的桑格法仍然在突变确认和对深内含子突变(如CEP290)以及鸟嘌呤胞嘧啶核苷酸富集区(如RPGR)的测序方面发挥着重要作用,这些突变难以利用NGS进行读取[5]。自1984年报道第一个与X-连锁视网膜色素变性(RP)相关的IRD基因以来,该领域进展颇多。历年来识别的基因数量稳步上升,截至2019年,已有271个基因确认与IRD相关[6]
2 IRD的基因治疗 
过去数十年中,对于视网膜营养不良、玻璃体视网膜手术技术和病毒载体的了解快速增加,为采用基因替换和其他等位基因靶向策略治疗这些疾病打下了坚实的基础。大多数情况下,是通过用疾病基因的正常拷贝体进行基因替换的。
2.1 视网膜的病毒载体 迄今已有包括慢病毒、腺病毒和腺相关病毒(AAV)在内的数种病毒载体用于基因治疗。慢病毒载体的优点包括其较大的互补DNA(CDNA)容量(8000~10 000碱基)和高效转导RPE细胞的能力[7],缺点包括其靶向分化的光感受器的能力较差,以及把它整合到靶细胞基因组中时有突变的风险。尽管腺相关病毒的容量较小(4800碱基),但它已成为眼部基因传递使用病毒载体的主要选择。这种重组的无包膜单链DNA病毒具有极低的免疫原性(优于腺病毒)和毒性[8],通过修饰病毒外壳和启动子区域,可以靶向在特定类型的视网膜细胞中表达蛋白。
2.2 靶向视网膜的可取之处 视网膜为基因治疗提供了一定优势,主要有:第一,视网膜下空间具有相对的免疫豁免[9],可将宿主对病毒载体的反应降至最低;第二,与全身给药相比,视网膜下给药只需较小的载体体积;第三,视网膜的解剖结构使载体给药期间更易进行监测及观察;最后,考虑到IRD进展的对称性,在评估安全性和有效性时,对侧眼可以作为对照。
2.3 递送载体的外科技术 玻璃体内注射和视网膜下注射是主要技术,前者最为简单,只需表面麻醉,通常在门诊进行。但出于对载体之于光感受器和RPE层的有效性和炎症的担忧[8],目前大多数都是通过平坦部玻璃体切割术进行视网膜下输送,此方法虽成熟但存在白内障和视网膜脱离的风险。目前,视网膜下输送的手术技术已经得到改进[10],如MicroDose注射套件,使用踏板式注射技术将病毒载体输送到视网膜下。术中OCT技术因其滤过泡实时可视化具有一定价值[11],由于术中视网膜下和中心凹定位准确,已应用于voretigene neparvovec-rzyl(卢克图纳眼内注射悬浮液)的视网膜下输送中。此外还有新的方法避免了玻璃体切割术及视网膜切开术,如通过脉络膜上腔向外视网膜下注射。
2.4 里程碑式药物voretgene neparvovec-rzyl voretgene neparvovec-rzyl是第一个FDA批准的针对遗传性疾病的基因替换治疗药物[12],经过多年相关基础和临床研究结果显示,接受该药治疗的参与者的光敏度、视野和在微光条件下行走的能力均表现出明显的改善[13]。这些有显著意义的变化在治疗后30 d就明显出现,并在治疗后1年和4年依然存在。治疗方法为玻璃体切割,视网膜下注射150×109个载体基因组,总体积0.3 mL。通常情况下,注射部位沿着颞上血管拱形,距离中心凹至少2 mm。目前,这种药物在美国的价格约为每眼需42.5万美元,不久将在欧洲上市。
3 最新的视网膜基因治疗试验  
3.1 先天性黑矇 先天性黑矇(LCA)是发生最早、最严重的IRD,出生时或出生后一年内双眼锥杆细胞功能会完全丧失,主要表现为婴幼儿期视力减退、神经性耳聋、肥胖、糖尿病、尿崩症、肾功能不全、性腺功能低下、高尿酸血症及高甘油三酯血症等,甚至先天性失明。可喜的是,LCA基因治疗试验的结果证明基因治疗IRD是十分可行的[14],尤其是RPE65介导的LCA基因治疗效果显著,且其具有一定的研究前景,这在两项临床二期试验中得到了充分的证实,在三期试验中更是获得了广泛的关注,并且创造了上述里程碑式的成果——腺相关病毒二型作为载体的基因治疗药物,即鼎鼎大名的voretgene neparvovec-rzyl。目前针对GUCY2D和CEP290相关的LCA,也已经展开了4个Ⅰ/Ⅱ 临床试验和一个三期临床试验。
3.2 色盲 色盲是一种视锥细胞营养不良眼病,其主要特征包括严重近视(日盲)、严重色盲和视力下降[15]。目前与色盲有关的基因有6个:CNGA3、CNGB3、GNAT2、PDE6C、PDE6H和ATF6[16],其中CNGB3和CNGA3突变分别占所有病例的50%和25%。目前,CNGB3和CNGA3的5个Ⅰ/Ⅱ 期临床试验正在进行中。
3.3 无脉络膜症 无脉络膜症是一种X-连锁视网膜营养不良,是由CHM基因突变引起的[17],其特征是RPE丢失,脉络膜毛细血管和光感受器继发性退化,表现为夜视和进行性外周视野萎缩。无脉络膜症第一阶段Ⅰ/Ⅱ临床试验的2年结果表明,经治疗的眼睛视力有显著和持续的改善(中位数4.5个字母增加,1.5个字母减少;P=0.04)。这些结果已经在其他试验中得到证实,还有几个正在进行或招募的试验,其中包括第三阶段试验。
3.4 Stargardt病与ABCA4 常染色体隐性遗传性Stargardt病的患病率为万分之一,由ABCA4基因突变所致[18]。常常由于黄斑RPE层和光感受器萎缩,在青春期之前即视力丧失。Stargardt病大多在恒齿生长期开始发病,是一种原发于RPE层的常染色体隐性遗传病,散发者亦非少见,较多发生于近亲婚配的子女患者,双眼受害,同步发展,无明显性别差异。它的病理生理包括视黄酰亚甲基磷脂酰乙醇胺(一种视黄醇中间体)在视杆和视锥细胞外段的转运和清除出现障碍,导致脂褐素在RPE中病理性堆积[19]。幸运的是,同LCA一样,基因治疗Stargardt病有显著的效果和广阔的研究前景。但值得注意的是,由于ABCA4基因太大(6800碱基),而腺相关病毒的容积又相对较小(4800碱基),故ABCA4基因不能包装在腺相关病毒(AAV)载体中。而一般使用cDNA容量更大的慢病毒(8000~10 000碱基),基于此,赛诺菲对27名受试者进行了视网膜下注射SAR422459的I/IIa期剂量递增安全性研究[20],并对46名受试者进行了更大规模的试验。这项研究工作正在进行中,结果尚未公布。
3.5 视网膜色素变性的基因治疗 视网膜色素变性(RP)是一种慢性、进行性、遗传性及营养不良性视网膜退行性变,典型的症状包括夜盲、进行性周边视野丧失,以及晚期由于视锥细胞退化造成的中心视力下降[21]。超过200个基因和3000多个突变与RP有关。遗传模式包括常染色体隐性(50%~60%)遗传、常染色体显性(30%~40%)遗传和X连锁隐性遗传(5%~15%)[22]。其中半数以上的X连锁隐性家系中发现了RP的GTPase调节器(RPGR)基因突变,目前针对此种RP已有数种载体的2个 Ⅰ/Ⅱ 期临床试验和1个 Ⅱ/Ⅲ 期研究有序进行中。在此之前,已有两项RPGR小鼠模型(RPGR-KO和RD9)的实验表明[23],接受治疗的小鼠在治疗4个月和6个月时的ERG反应有所改善。
另一方面,原癌基因酪氨酸激酶(MERTK)相关RP的基因替代治疗研究也有了进展。一项Ⅰ期临床试验表明6名接受了人MERTK构建体视网膜下注射的受试者中[24],有3名显示出可测量的视力改善。以及在PDE6B相关RP中一项犬模型的实验证实,AAV2转染PDE6B基因的方法在3年中持续阻止了视杆细胞的退化[25]
3.6 Usher综合征一型的基因治疗 Usher综合征又称遗传性耳聋-色素性视网膜炎综合征,是以先天性感音神经性聋、渐进性RP而致视野缩小、视力障碍为主要表现的一种常染色体隐性遗传性疾病,包括3个临床亚型[26],且有9个基因与之相关。其中Usher综合征1B是由MYO7A突变引起的,MYO7A编码肌球蛋白VIIA,肌球蛋白VIIA是光感受器内外节段之间纤毛运输的重要蛋白[27]。此型患者耳聋和光感受器功能障碍在出生时就表现出来了,随后出现视网膜变性。一项英国的Ⅱ期临床试验目前正对MYO7A基因疗法进行评估,该研究使用慢病毒作为载体携带基因产物并进行视网膜下注射,在受试的4例患者中均表现出良好的安全性。
3.7 X-连锁视网膜劈裂症的基因治疗 X-连锁视网膜劈裂症(XLRS)由视黄蛋白1(Rs1)基因突变引起,是一种遗传性视网膜营养不良,主要患病人群为男性[28],其特征是视网膜各层分裂,导致从光感受器到双极细胞的突触传递受损。此前的一项小鼠模型实验显示,玻璃体内注射人Rs1基因可有效地使这种多肽恢复正常[29]
3.8 其他治疗手段 除了之前所叙述的基因替换治疗IRD,目前也诞生了更多新颖的方法来实现突变特异性或等位基因特异性靶向。成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)-Cas9是一种RNA引导的核酸酶技术[30],它对于解决常染色体显性疾病等不适用传统基因替换的疾病有巨大帮助。具体来说,CRISPR-Cas9介导DNA断裂再由同源定向修复或非同源末端连接修复,而这其中核苷酸的缺失或插入是有利于CRISPR介导的基因校正的,在这一基础上再分化出RPE和光感受器等分化细胞[31]。已经有研究人员开展了利用这种方法治疗CEP290基因深内含子突变引起的LCA的二期临床试验[32]
另外一种治疗IRD的新疗法是使用反义寡核苷酸来靶向IRD中涉及的异常前信使RNA[33],从而以等位基因特异性的方式调节mRNA编辑中的剪接过程。但玻璃体内注射反义寡核苷酸的安全性和有效性仍有待评估。
4 研究前景 
关于基因疗法的治疗案例和实验的数量每年都在不断地增加,这种精准而有效的医疗手段在逐步走向成熟。而伴随着这种技术的进步,视网膜作为一个在免疫原性和组织结构上具有显著优势的靶向目标,使得IRD的基因治疗领域表现较为优越[34],一方面是精确的分子诊断,另一方面是精准的手术治疗。这一领域目前不仅包括传统的基因增强方法(基因替换治疗),而且也迅速扩展到使用CRISPR或反义技术的等位基因特异性或突变特异性抑制的前沿方法。同时通过广泛使用大量已获悉的与IRD相关的基因,使得我们更加清楚地认识到每例患者的基因改变。并在此基础上提高了诊断效率以便进行及时治疗。在宽度上,记录显示最小的接受基因治疗的对象为年仅22个月的LCA患者(幼儿眼球震颤要因)[35],而在接受这一治疗的广度上,全球预计550万IRD患者将受到影响,其中半数以上会接受基因诊断,接受这一治疗的患者数量也将十分可观。
视网膜外科手术的进展也是视网膜基因治疗不可或缺的支柱。视网膜下递送技术被证实是行之有效且安全的,特别是随着玻璃体视网膜手术可视化和仪器的不断改进。虽然玻璃体腔入路是一种不错的常规手术,但目前看来视网膜下入路是获得光感受器和RPE层的最佳途径。
因此,在对IRD患者进行基因治疗时,一定需要多学科诊疗。这是一种新颖的模式,需要生物信息专家和分子病理学家与临床医师共同合作,而临床医师又需要得到遗传咨询师、高级诊断测试(如显微视野检查、全视野暗视敏感阈值测试)和ERG的帮助。