《眼科新进展》  2020年6期 533-537   出版日期：2020-06-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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LINC00473调控miR-210/TET2分子轴对H₂O₂诱导的人晶状体上皮细胞生物学特性的影响


????????白内障会降低老年人生活质量，给患者带来巨大的经济和精神负担，已成为全球重大的公共卫生问题^［1］。既往研究显示，人晶状体上皮细胞（human lens epithelial cells,hLECs）凋亡是白内障发生的病理基础，而氧化应激损伤是导致hLECs凋亡的主要危险因素^［2］。探讨hLECs增殖、凋亡和氧化应激损伤的分子机制对防治白内障意义重大。长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸且无蛋白编码潜能的RNA转录本。最近研究表明，lncRNA参与细胞增殖、凋亡、氧化应激损伤等多种病理生理过程，在眼部正常发育中起着重要作用^［3-4］。LINC00473是位于染色体6q27位点的基因间lncRNA，其参与宫颈癌^［5］、胰腺癌^［6］等多种肿瘤细胞生长、存活的调控，沉默LINC00473可抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡。此外，LINC00473还可调控滋养细胞的增殖和凋亡，与子痫前期的发生发展有关^［7］。然而，目前未见LINC00473与hLECs的相关报道。H₂O₂可诱导hLECs氧化应激损伤和凋亡，是研究白内障常用的体外细胞模型的建立方法^［8-9］。因此，本研究通过检测LINC00473在H₂O₂诱导的hLECs中的表达水平，初步揭示其调控细胞增殖、凋亡以及氧化应激损伤的分子机制，以期为基于hLECs防治白内障提供新的方法。
1　材料与方法　
1.1　实验材料　hLECs SRA01/04细胞购于上海拜力生物科技有限公司；DMEM低糖培养基、胎牛血清和青霉素、链霉素溶液购于美国Hyclone公司；H₂O₂购于美国Sigma公司；Lipofectamine^TM 2000、TRIzol试剂购于美国Invitrogen公司；兔抗半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）、P21、10-11易位酶2（ten-eleven trantranslocation 2，TET2）抗体以及山羊抗兔IgG购于美国Abcam公司；pcDNA3.1-LINC00473、pcDNA3.1、si-NC、si-LINC00473、si-TET2、miR-NC、miR-210mimics、anti-miR-NC、anti-miR-210、WT-LINC00473、MUT-LINC00473、WT-TET2、MUT-TET2由上海吉玛制药公司提供；cDNA合成试剂盒、SYBR Green Realtime PCR试剂盒购于日本Toyobo公司；细胞计数试剂盒（cell counting kit-8，CCK-8）购于上海贝博生物；丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量检测试剂盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）以及谷胱甘肽过氧化物酶（glutathion peroxidase，GSH-Px）活性检测试剂盒购于北京索莱宝科技公司。
1.2　细胞培养和模型构建　SRA01/04细胞采用DMEM低糖培养基（含体积分数10%胎牛血清和10 g·L^-1青-链霉素）在37 ℃、含体积分数5%CO₂的培养箱内培养。当细胞融合度达90%时消化传代。细胞培养液内加入100 μmol·L^-1 H₂O₂后于培养箱内培养24 h，建立H₂O₂细胞损伤模型。
1.3　细胞分组处理　将SRA01/04细胞按照每孔200×10³个细胞接种于6孔板，当细胞融合度达到50%时按照脂质体转染试剂Lipofectamine^TM 2000说明书将pcDNA3.1-LINC00473、pcDNA3.1分别转染至SRA01/04细胞，经H₂O₂诱导后，依次标记为H₂O₂+pcDNA3.1-LINC00473组、H₂O₂+pcDNA3.1组。同时设置Con组（正常对照组）、H₂O₂组（仅建立H₂O₂细胞损伤模型）。
1.4　实验方法　收集细胞，流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况， CCK-8法检测各组细胞存活率，严格按照试剂盒说明书步骤检测各组细胞中MDA含量以及SOD、GSH-Px活性。 同时进行以下实验。
1.4.1　集落形成实验　将对数生长期的各组细胞按照每孔200个接种于6孔板，米字型方向轻轻晃动平板使细胞分散均匀，培养7 d后观察细胞生长情况，当出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养，弃去细胞培养基，固定和染色后，显微镜下观察拍照，计算克隆形成数。实验重复3次。
1.4.2　RT-qPCR检测　利用TRIzol试剂提取各组细胞总RNA，以cDNA第一链合成试剂盒逆转录合成cDNA，利用SYBR Green Realtime PCR试剂盒进行PCR扩增。以GAPDH为内源性参照，运用2^-ΔΔCt法分析LINC00473的表达水平。引物序列为：LINC00473上游引物:5’-GATGGAAAGGAGGGAAGG-3’，下游引物:5’-CACAGTGGGTCCAGGGTT-3’；GAPDH上游引物:5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGT-3’，下游引物:5’-GATGGCAACAATATCCACTT-3’。
1.4.3　Western blot检测　收集各组细胞获得细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度后，按照每泳道 40 μg 蛋白样品上样进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用湿法转膜将已分离的细胞蛋白转移至硝酸纤维素膜，洗膜后，将膜置于50 g·L^-1脱脂牛奶中封闭1 h，洗膜后将膜置于稀释的一抗（Caspase-3为1∶500，P21为1∶1000,TET2为1∶250)溶液中室温孵育2 h，洗膜后，将膜置于稀释的二抗（1∶2000）溶液中室温孵育1 h。加入化学发光试剂避光显色后，Quantity One软件分析蛋白表达水平。
1.4.4　双荧光素酶报告基因实验　等线生物信息学分析工具starBase进行靶基因预测，发现LINC00473与miR-210之间存在结合位点，targetscan进行靶基因预测，发现miR-210与TET2之间存在结合位点，采用双荧光素酶报告基因实验验证LINC00473与miR-210、miR-210与TET2靶向调控关系。将WT-LINC00473、MUT-LINC00473、WT-TET2、MUT-TET2分别与miR-NC、miR-210 mimics共转染至SRA01/04细胞，转染48 h后，测定各组细胞荧光素酶活性。同时将pcDNA3.1、pcDNA3.1-LINC00473、si-NC、si-LINC00473分别转染hLECs SRA01/04细胞，以U6为内参， 参照1.4.2方法检测miR-210的表达水平。将miR-NC、miR-210 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-210分别转染SRA01/04细胞，以GAPDH为内参，参照1.4.2方法检测TET2的表达水平。引物序列为：miR-210上游引物：5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’，下游引物：5’-CTGTGCGTGTGACAGCGGCTGA-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’；TET2上游引物：5’-TAAGTGGGTGGTTCGCAGA-3’，下游引物：5’-TCCGAGTAGAGTTTGTCAGCC-3’。
1.4.5　LINC00473调控miR-210/TET2分子轴影响H₂O₂诱导的hLECs增殖、凋亡以及氧化应激损伤　为验证LINC00473是否通过调控miR-210/TET2分子轴进而影响H₂O₂诱导的hLECs增殖、凋亡以及氧化应激损伤，将pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC、pcDNA3.1-LINC00473+miR-210、pcDNA3.1-LINC00473+si-NC、pcDNA3.1-LINC00473+si-TET2分别转染SRA01/04细胞，经H₂O₂诱导后，再次检测细胞存活率、凋亡率、克隆形成数、MDA含量以及SOD和GSH-Px活性。
1.5　统计学分析　采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，所有结果均采用x?±s表示。两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步组间比较采用SNK-q检验。检验水准：α=0.05。
2　结果　
2.1　LINC00473对H₂O₂诱导的SRA01/04细胞的影响　与Con组比较，H₂O₂组SRA01/04细胞LINC00473的表达水平显著降低，Caspase-3和P21蛋白的表达显著升高，细胞克隆形成数显著减少，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；与H₂O₂+pcDNA3.1组比较，H₂O₂+pcDNA3.1-LINC00473组SRA01/04细胞LINC00473的表达水平显著升高，Caspase-3和P21蛋白的表达显著降低，细胞克隆形成数显著增加，细胞存活率显著升高，细胞凋亡率显著降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。与Con组比较，H₂O₂组SRA01/04细胞中SOD和GSH-Px活性均显著降低，MDA含量显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；与H₂O₂+pcDNA3.1组比较，H₂O₂+ pcDNA3.1-LINC00473组SRA01/04细胞中SOD和GSH-Px活性均显著升高，MDA含量显著降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。见表1和表2。
2.2　LINC00473靶向调控miR-210　starBase预测发现，LINC00473与miR-210之间存在部分连续互补的核苷酸序列，见图1。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-NC和WT-LINC00473共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性（0.36±0.03）较miR-210 mimics和WT-LINC00473共转染组（0.96±0.10）显著降低（P<0.05）；miR-NC和MUT-LINC00473共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性（1.04±0.10）与miR-210 mimics和MUT-LINC00473共转染组（0.99±0.10）相比，差异无统计学意义（P>0.05）。RT-qPCR检测结果显示，上调LINC00473表达后，SRA01/04细胞miR-210的表达水平（0.23±0.02）较正常SRA01/04细胞（1.00±0.10）显著降低（P<0.05）；干扰LINC00473表达后，SRA01/04细胞miR-210的表达水平（2.11±0.22）较正常SRA01/04细胞显著升高（P<0.05）。以上结果表明,LINC00473靶向负调控miR-210表达。







2.3　过表达miR-210逆转LINC00473对H₂O₂诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及氧化损伤的影响　与H₂O₂+ pcDNA3.1-LINC00473+ miR-NC组SRA01/04细胞中miR-210(1.01±0.10)、Caspase-3蛋白（0.31±0.03)和P21蛋白（0.38±0.04)表达比较，H₂O₂+ pcDNA3.1-LINC00473+ miR-210组SRA01/04细胞miR-210（1.89±0.17)、Caspase-3蛋白（0.66±0.07)和P21蛋白（0.79±0.08)的表达水平均显著升高。与H₂O₂+pcDNA3.1-LINC00473+miR-NC组相比，H₂O₂+pcDNA3.1-LINC00473+miR-210组的细胞克隆形成数显著减少，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，SOD和GSH-Px活性均显著降低，MDA含量显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。见表3。



2.4　miR-210靶向调控TET2　miR-210与TET2之间存在部分连续互补的核苷酸序列，见图2。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-NC和WT-TET2共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性（0.33±0.03）较miR-210 mimics和WT-TET2共转染组（0.94±0.09）显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）；miR-NC和MUT-TET2共转染组SRA01/04细胞荧光素酶活性（1.00±0.10）较miR-210 mimics和MUT-TET2共转染组（0.96±0.09）变化不明显，差异无统计学意义（P>0.05）。RT-qPCR和Western blot检测结果显示，上调miR-210表达后，SRA01/04细胞TET2 mRNA（0.34±0.03）和蛋白（0.20±0.02）的表达水平均较正常SRA01/04细胞TET2 mRNA（1.01±0.10）和蛋白（0.61±0.06）的表达水平显著降低；下调miR-210表达后，SRA01/04细胞TET2 mRNA（1.88±0.18）和蛋白（1.45±0.15）的表达水平均较正常SRA01/04细胞显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。提示miR-210靶向负调控TET2表达。



2.5　抑制TET2逆转LINC00473对H₂O₂诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及氧化损伤的影响　与H₂O₂+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-NC组TET2质粒（0.88±0.08)、Caspase-3蛋白(0.29±0.03)、P21蛋白（0.37±0.03)表达比较，H₂O₂+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-TET2组SRA01/04细胞TET2质粒(0.24±0.02)表达显著降低，Caspase-3蛋白（0.72±0.07)和P21蛋白（0.85±0.08)表达均显著升高。与H₂O₂+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-NC组相比，H₂O₂+ pcDNA3.1-LINC00473+ si-TET2组细胞克隆形成数显著减少，细胞存活率显著降低，细胞凋亡率显著升高，SOD和GSH-Px活性显著降低，MDA含量显著升高（均为P<0.05），见表3。
3　讨论　
????????白内障是全球致盲的主要眼病之一，全球约50%的失明患者是由白内障引起的^［10］。晶状体是由单层上皮细胞构成的透明器官，氧化应激引起的hLECs损伤和凋亡是引发白内障的主要原因。本研究通过H₂O₂诱导hLECs氧化应激损伤和凋亡，探索与其相关的基因，以期为基于hLECs防治白内障提供新的方法。
????????LINC00473是乳腺癌预后的独立影响因素，其高表达与乳腺癌患者的淋巴结转移、临床分期及预后较差有关，抑制LINC00473表达可抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡^［11］。LINC00473在胶质瘤中表达上调，干扰LINC00473可抑制胶质瘤细胞的增殖和肿瘤生长，抑制胶质瘤进展^［12］。本研究结果表明，H₂O₂诱导后SRA01/04细胞存活率和克隆形成能力均显著降低，P21的表达显著升高，LINC00473的表达水平显著降低；上调LINC00473表达后，SRA01/04细胞存活率和克隆形成能力均显著升高，说明上调LINC00473表达可提高SRA01/04细胞的增殖能力。正常机体内存在SOD、GSH-Px等抗氧化酶防御系统，可清除自由基，保护机体免受氧化应激损伤，维持机体正常代谢活动。本研究结果显示，H₂O₂诱导后SRA01/04细胞脂质过氧化产物MDA含量显著升高，SOD、GSH-Px的活性显著降低，而上调LINC00473可显著降低MDA含量，提高SOD和GSH-Px活性。因此，LINC00473可抑制H₂O₂诱导的SRA01/04细胞氧化应激损伤。同时本研究结果显示，H₂O₂诱导后SRA01/04细胞中Caspase-3的表达水平显著升高，细胞凋亡率显著增加，而上调LINC00473可抑制H₂O₂诱导的细胞凋亡。以上结果表明，上调LINC00473可促进细胞增殖，抑制H₂O₂诱导的氧化应激损伤和凋亡，进而对SRA01/04细胞发挥保护作用。
????????有研究表明，miRNA异常表达与晶状体发育、LECs的凋亡、晶状体透明度降低以及白内障的发生关系密切^［13］。为探讨LINC00473对SRA01/04细胞的保护作用机制，本研究通过序列分析发现，miR-210是LINC00473的潜在功能性靶基因之一。miR-210在hLECs氧化损伤中表达上调，且其在年龄相关性白内障患者晶状体组织中亦是高表达，miR-210高表达可促进LECs凋亡^［14-15］。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实，LINC00473靶向负性调控miR-210表达，过表达miR-210可逆转LINC00473对H₂O₂诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡以及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响。
????????TET2是TET蛋白家族成员之一。有研究显示，TET2参与病理条件下神经元细胞存活过程，上调TET2对氧化应激介导的神经元损伤的细胞保护作用^［16］。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实miR-210可靶向负性调控TET2表达，进一步研究显示，抑制TET2表达能逆转LINC00473对H₂O₂诱导的SRA01/04细胞增殖、凋亡及SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影响。提示LINC00473通过调控miR-210/ TET2分子轴可减轻H₂O₂诱导的hLECs氧化应激损伤和凋亡。
????????综上所述，LINC00473在H₂O₂诱导的hLECs中表达下调，上调LINC00473表达通过调控miR-210/TET2分子轴可促进细胞增殖，抑制H₂O₂诱导的氧化应激损伤和凋亡，进而对hLECs发挥保护作用，为基于hLECs防治白内障提供了新的方向。