白内障是临床上常见眼病之一，内质网样氧化应激反应可促使人晶状体上皮细胞凋亡，进而导致白内障发生［1］。目前，临床上可通过手术治疗白内障，但手术极易产生后囊膜混浊等并发症，因而深入了解白内障发生机制并积极寻找治疗靶点十分重要。H2O2处理人晶状体上皮细胞可影响细胞活性，并诱导细胞凋亡［2］。研究表明，Krüppel样因子6(Krüppel like factor 6，KLF6)，又称锌指转录因子6，在大鼠晶状体上皮细胞中高表达，并可通过降解p21和p27kip1进而抑制细胞增殖［3］。KLF6可通过活化ATF4促进晶状体上皮细胞凋亡［4］。但KLF6在H2O2诱导的人晶状体上皮细胞的表达变化及其上游调控微小RNA（microRNA，miRNA）的作用尚未见报道。miRNA是一种内源性非编码单链RNA分子，miRNA可通过调控下游基因表达进而参与白内障发生及发展过程，但其具体作用机制尚未完全阐明［5-6］。研究表明，体外和体内上调微小RNA-124（microRNA-124，miR-124）可减轻脊髓损伤后的氧化损伤［7］。通过靶基因预测软件发现，KLF6可能是微小RNA-124-3p（microRNA-124-3p，miR-124-3p）靶基因，然而miR-124-3p是否通过调控KLF6对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞增殖、凋亡产生影响尚未见相关报道。因此，本研究通过观察人晶状体上皮细胞在H2O2作用前后miR-124-3p与KLF6的表达变化，初步分析其对人晶状体上皮细胞增殖及凋亡的影响，为深入分析白内障发病机制提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
人晶状体上皮细胞系HLE-B3购自吉妮欧生物科技有限公司。RPMI 1640培养基、胰蛋白酶、体积分数10%胎牛血清、10 g·L-1青霉素及链霉素均购自美国Gibco公司；Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司；miR-124-3p模拟物（mimics）、miR-124-3p抑制剂（anti-miR-124-3p）及其各自阴性对照均购自广州锐博生物科技有限公司；siRNA KLF6（si-KLF6）及其阴性对照（si-NC）均购自上海吉玛制药技术有限公司；兔抗人KLF6多克隆抗体购自美国Abcam公司；兔抗人GAPDH单克隆抗体购自美国CST公司；Trizol试剂购自北京索莱宝科技有限公司；反转录试剂盒与SYBR Premix Ex Taq试剂盒均购自日本TaKaRa公司；PVDF膜购自德国Millipore公司；甲基四唑蓝（MTT）购自美国Sigma公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司；膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（FITC）细胞凋亡试剂盒购自大连美仑生物技术有限公司；兔抗人Cyclin D1单克隆抗体购自美国Santa cruz公司；鼠抗人p21单克隆抗体购自美国NeoMarker公司；兔抗人Bax、Bcl-2抗体购自美国ProteinTech公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔与山羊抗鼠IgG二抗购自江苏碧云天生物技术有限公司；H2O2购自上海抚生实业有限公司。
1.2 方法
1.2.1 H2O2诱导细胞模型构建
不含胎牛血清RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培养基加入终浓度为100 μmol·L-1 H2O2，将未经处理的HLE-B3细胞作为HLE-B3组，H2O2诱导48 h的HLE-B3细胞作为HLE-B3+H2O2组。同时另将H2O2加入到转染后各组HLE-B3细胞中，放入37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱内继续培养48 h后收集细胞［8］，严格参照Lipofectamine2000试剂盒说明书进行操作。
1.2.2 细胞培养、转染及实验分组
HLE-B3细胞培养于含体积分数10%胎牛血清RPMI 1640培养基，置于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱培养，取对数生长期的HLE-B3细胞以5000个·mL-1的浓度接种于6孔板，调整细胞浓度为（100×103个·mL-1），待细胞浓度达到40%~60%进行转染，参照Lipofectamine2000转染试剂盒说明书分别将miR-124-3p mimics与miR-NC加入到HLE-B3细胞，si-NC与si-KLF6加入到HLE-B3细胞，分别为miR-NC组、miR-124-3p组、si-NC组、si-KLF6组。收集各组转染后12 h的细胞，均使用100 μmol·L-1 H2O2处理细胞48 h，分别为HLE-B3+H2O2+miR-NC组、HLE-B3+H2O2+miR-124-3p组、HLE-B3+H2O2+si-NC组、HLE-B3+H2O2+si-KLF6组。共转染组为miR-124-3p mimics与pcDNA3.1共转染至HLE-B3细胞，miR-124-3p mimics与pcDNA3.1-KLF6共转染至HLE-B3细胞，分别命名为miR-124-3p+pcDNA3.1组、miR-124-3p+pcDNA3.1-KLF6组。
1.2.3 qRT-PCR检测HLE-B3细胞中miR-124-3p、KLF6 mRNA表达
收集各组对数生长期HLE-B3细胞，加入200 μL氯仿，振荡5 s后室温放置5 min，12×103 r·min-1离心15 min，吸取上层水相层放入另一无菌无酶的1.5 mL EP试管内，加入500 μL 异丙醇振荡5 s后室温放置20 min，12×103 r·min-1离心15 min，弃上清，加入体积分数75%乙醇混合后12×103 r·min-1离心5 min，晾干后加入适量DEPC水溶解RNA。紫外分光光度计检测RNA浓度，按照反转录试剂盒说明书得到cDNA，根据试剂盒说明书配置qRT-PCR反应体系；反应条件为95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共循环40次。2-ΔΔCt法计算miR-124-3p、KLF6 mRNA相对表达量。
1.2.4 Western blot检测KLF6、Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表达
取各组对数生长期HLE-B3细胞，PBS洗5 min×3次，以每孔500 μL的密度加入RIPA裂解液，冰上放置5 min，刮取细胞置于1.5 mL离心管，冰上静置5 min，12×103 r·min-1 离心10 min，收集上清提取蛋白。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，反应结束后将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，50 g·L-1脱脂奶粉封闭1 h，加入蛋白一抗（稀释比例为1∶1000）4 ℃下孵育24 h，TBST洗10 min×3次，加入蛋白二抗（稀释比例为1∶5000），TBST洗10 min×3次，滴加ECL显影，放入凝胶成像仪曝光并应用Quantityone软件检测条带灰度值。蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。
1.2.5 细胞增殖实验
收集转染后各组HLE-B3细胞，置于37 ℃、体积分数5%CO2培养箱，分别于培养12 h、24 h、36 h时，12×103 r·min-1离心10 min，弃上清液，每孔加入5 g·L-1 MTT溶液20 μL，放入37 ℃恒温培养箱内继续培养4 h，12×103 r·min-1离心10 min，弃上清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）100 μL，涡旋振荡后置于全自动酶标仪检测波长为490 nm处各孔光密度值（A值），每组实验均设置3次重复。
1.2.6 细胞凋亡实验
收集各组对数生长期HLE-B3细胞，2.5 g·L-1胰蛋白酶消化细胞，预冷PBS洗涤细胞，4 ℃下2000 r·min-1离心10 min，弃上清，加入1 mL结合缓冲液调整细胞浓度为100×103个·mL-1，加入5 μL Annexin V-FITC/PI双染试剂，室温下避光孵育20 min，冰上放置5 min，加入500 μL结合缓冲液，充分混合均匀后放入流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.7 双荧光素酶报告基因实验
靶基因预测库预测miR-124-3p的靶基因，结果发现miR-124-3p与KLF6的3’UTR存在结合位点，构建野生型KLF6的3’UTR（WT-KLF6）质粒，突变型KLF6的3’UTR（MUT-KLF6），收集对数生长期HLE-B3细胞，用含体积分数10%胎牛血清及10 g·L-1青霉素-链霉素混合溶液的RPMI 1640培养基调整细胞密度为每孔200×103个，将WT-KLF6、MUT-KLF6与miR-124-3p mimics或阴性对照共转染至HLE-B3细胞，放入37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱继续培养48 h，检测细胞荧光素酶活性。
1.3 统计学方法
本研究数据分析采用SPSS 19.0统计学软件，结果以x?±s表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 miR-124-3p、KLF6在H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3中的表达
与HLE-B3组细胞相比，HLE-B3+H2O2组HLE-B3中miR-124-3p表达水平显著降低（P＜0.05），而KLF6 mRNA及蛋白表达水平显著升高（P＜0.05）。见表1。
2.2 过表达miR-124-3p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖的影响
HLE-B3+H2O2+miR-124-3p组HLE-B3中miR-124-3p的表达水平显著高于HLE-B3+H2O2+miR-NC组（P＜0.05）。相较于HLE-B3+H2O2+miR-NC组，HLE-B3+H2O2+miR-124-3p组HLE-B3细胞活性显著增强（P＜0.05）。Western blot检测结果显示，HLE-B3+H2O2+miR-124-3p组HLE-B3细胞中 Cyclin D1蛋白表达水平与HLE-B3+H2O2+miR-NC组相比显著升高（P＜0.05），而P21蛋白表达水平显著降低（P＜0.05）。见表2、表3。
2.3 过表达miR-124-3p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3凋亡的影响
与HLE-B3+H2O2+miR-NC组相比，HLE-B3+H2O2+miR-124-3p组H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3凋亡率显著降低（P＜0.05）。Western blot检测细胞凋亡相关蛋白表达结果显示，HLE-B3+H2O2+miR-124-3p组H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3中Bax蛋白表达水平显著降低（P＜0.05），而Bcl-2蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），见表4、图1。
2.4 miR-124-3p靶向调控KLF6的表达
双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-124-3p mimics、野生型载体WT-KLF6共转染至HLE-B3细胞后细胞荧光素酶活性（0.27±0.03）低于阴性对照、WT-KLF6共转染组（0.98±0.08）（P＜0.05），miR-124-3p mimics、突变型载体MUT-KLF6共转染（1.01±0.09）与阴性对照、MUT-KLF6共转染组比较（0.96±0.08），差异无统计学意义（P＞0.05）。qRT-PCR 与Western blot实验分别检测miR-124-3p过表达或抑制miR-124-3p表达后HLE-B3细胞中KLF6 mRNA及蛋白表达变化，miR-124-3p过表达后HLE-B3细胞中KLF6 mRNA及蛋白表达水平均显著降低（均为P＜0.05），而抑制miR-124-3p表达后HLE-B3细胞中KLF6 mRNA及蛋白表达水平均显著升高（均为P＜0.05）。见表5。
2.5 抑制KLF6表达对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖、凋亡的影响
si-KLF6转染至HLE-B3细胞后用H2O2诱导处理结果显示，HLE-B3+H2O2+si-KLF6组HLE-B3细胞中KLF6蛋白表达水平较HLE-B3+H2O2+si-NC组显著降低（P＜0.05），细胞增殖活性显著增强（P＜0.05），细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达水平均显著升高（均为P＜0.05），P21、Bax蛋白表达水平均显著降低（均为P＜0.05），见图2、表6、表7。
2.6 过表达KLF6逆转miR-124-3p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖、凋亡的作用
与miR-124-3p+pcDNA3.1组比较，miR-124-3p+pcDNA3.1-KLF6 组HLE-B3细胞增殖活力明显降低（P＜0.05），细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），能够明显促进P21、Bax蛋白表达（均为P＜0.05），显著抑制Cyclin D1、Bcl-2表达（均为P＜0.05），见图3、表8、表9。这表明，过表达KLF6可逆转miR-124-3p对H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖的促进作用及其对细胞凋亡的抑制作用。
3 讨论
年龄相关性白内障是损害视力甚至导致失明的重要原因，随着年龄的增长，白内障发生率逐渐升高，白内障会严重降低患者的生活质量［9］。氧化应激反应可参与白内障发生及发展过程，已有研究表明H2O2可诱导人晶状体上皮细胞凋亡，但其具体作用机制尚未完全阐明［10］。还有研究发现，miRNA可参与细胞增殖、凋亡及氧化应激等多种病理过程，同时发现miRNA表达异常与白内障等年龄相关性疾病的发生及发展密切相关［11］。因此，阐明miRNA在白内障发生及发展过程中的作用，并探讨其是否可拮抗氧化应激相关的晶状体上皮细胞凋亡，可为揭示白内障发病机制奠定一定的理论基础。
miR-124-3p可通过靶向STAT3表达而降低氧化应激反应，进而减弱MPP+诱导的神经元损伤［12］。Wu等［13］研究表明，白内障晶状体样本中抗氧化基因miR-124-3p表达下调，靶向促氧化基因的3’UTR并且还可以结合抗氧化基因的TATA盒区域，进而参与白内障发生，但其具体作用机制尚未完全阐明。Dong等［14］研究表明，miR-124-3p可通过调节ANAX5在6-羟基多巴胺诱导的帕金森病细胞模型中发挥神经保护作用。Wei等［15］研究表明，miR-124-3p表达水平降低可能是引发白内障的主要作用机制之一。本研究发现，H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3中miR-124-3p表达水平显著降低，说明H2O2可降低人晶状体上皮细胞HLE-B3中miR-124-3p的表达。本研究还发现，上调miR-124-3p表达可促进HLE-B3细胞增殖并抑制细胞凋亡。提示miR-124-3p可通过促进人晶状体上皮细胞增殖并抑制其凋亡进而参与白内障发生过程。同时本研究进一步检测发现，miR-124-3p过表达后HLE-B3细胞中Cyclin D1、Bcl-2表达水平明显升高，而P21、Bax表达水平明显降低。Cyclin D1是Wnt/β-catenin信号通路的核内靶基因之一，并可调控细胞增殖，Cyclin D1表达水平升高可通过促进细胞周期向S期转换进而促进细胞进入分裂期导致晶状体上皮细胞增殖，而P21高表达可抑制Cyclin D1与CDK结合，进而抑制细胞周期进展最终影响白内障发生［16］。已有研究表明，促进Bcl-2蛋白表达及抑制Bax蛋白表达可抑制线粒体凋亡途径，进而抑制H2O2诱导的晶状体上皮细胞凋亡，从而减轻H2O2诱导的氧化损伤［17］。提示miR-124-3p过表达可通过影响细胞增殖及凋亡相关蛋白表达而抑制H2O2诱导的晶状体上皮细胞凋亡并促进细胞增殖。
有研究报道指出，KLF6可调控细胞增殖、分化及凋亡等多种生理或病理过程［18］。白内障患者术后其房水内部环境可发生改变，细胞上皮标志蛋白E-cadherin表达水平降低可促使晶状体上皮细胞迁移进而增加白内障并发症的发生率，KLF6高表达可通过影响细胞-上皮间质转化进程，进而促进TGF-β2诱导的晶状体上皮细胞纤维化过程，沉默KLF6表达可保护晶状体上皮细胞［19］。本研究结果表明，H2O2诱导的人晶状体上皮细胞中KLF6的表达水平显著升高，抑制KLF6表达后细胞增殖能力明显增强，而细胞凋亡能力明显受到抑制，并可明显促进Cyclin D1、Bcl-2蛋白表达及抑制P21、Bax蛋白表达，说明沉默KLF6可通过影响细胞增殖及凋亡相关蛋白表达进而促进H2O2诱导的人晶状体上皮细胞增殖并抑制其凋亡。同时双荧光素酶报告基因实验证明，KLF6是miR-124-3p的靶基因，为验证miR-124-3p是否通过抑制KLF6表达而发挥对人晶状体上皮细胞的保护作用，将miR-124-3p mimics与pcDNA3.1-KLF6共转染至HLE-B3细胞，结果发现共转染后明显抑制HLE-B3细胞增殖并促进细胞凋亡，说明H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖及凋亡过程中miR-124-3p 与KLF6均发挥了一定的调控作用。提示miR-124-3p 可通过抑制靶基因KLF6表达进而促进H2O2诱导的人晶状体上皮细胞HLE-B3增殖并抑制其凋亡。
综上所述，特异性上调人晶状体上皮细胞中miR-124-3p 的表达可通过抑制KLF6表达而提高细胞的抗氧化能力，进而抑制或减缓白内障发生及发展过程。本研究结果有助于全面了解miR-124-3p对晶状体上皮细胞增殖及凋亡的调控作用，为靶向调控miR-124-3p表达而预防白内障发生及发展提供了一定的理论依据。