低氧低温是高原环境的特点之一，低氧对人体各部分组织尤其是耗氧量高的神经系统会产生一定的影响［1］。视网膜作为神经系统的延伸部分，对缺氧尤为敏感，在急性低压低氧条件下，视网膜会出现静脉扩张、出血、水肿和棉絮斑等现象［2］。线粒体作为能量储存和供给的重要场所，是参与视网膜细胞代谢的主要细胞器。低压低氧环境使细胞氧化磷酸化下降、线粒体电子传递链受阻，从而影响有氧代谢［3］。我们前期研究提示，低压低氧通过调节缺氧相关因子和调控凋亡相关基因而影响视网膜功能［4］。本研究进一步探讨低压低氧对视网膜线粒体功能的影响以及黄芪复方（radix astragali seu hedysari compound，RAHC) 的干预作用及机制。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物
雄性健康SD大鼠42只［实验动物许可证号SCXK（陕）2018-001］，由西安交通大学动物实验中心提供，体质量（200±20）g。
1.1.2 主要试剂和仪器
RAHC（黄芪20 g、人参10 g、玉竹9 g、枸杞9 g、白术6 g、甘草6 g），按传统方法煎煮过滤，并于恒温水浴锅中浓缩成11.76 g·mL-1 的生药。BCA法蛋白测定试剂盒、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase，SDH）测试盒（南京建成生物工程研究所）。大鼠细胞色素氧化酶（cytochrome c oxidase，COX）联免疫试剂盒（武汉华美科技有限公司）。细胞色素C（cytochrome C，Cytc）抗体（美国 proteintech公司）；RNA逆转录试剂盒（TAKARA公司），SYBR GREEN试剂盒、384孔RT-PCR板、RT-PCR反应膜、荧光定量PCR仪（美国ABI公司），RT-PCR引物（上海生工生物工程有限公司），光学显微镜（日本Nikon公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物造模
将42只健康SD大鼠随机分成3组，正常氧含量对照组（常氧组）、低氧组、RAHC干预组各14只。常氧组在正常氧环境下喂养，低氧组和RAHC干预组置于模拟5000 m海拔环境的低压氧舱，每天降舱后，加食、喂水，RAHC干预组大鼠每天予以RAHC汤药0.1 g·kg-1灌胃，低氧组予以同等剂量生理盐水灌胃，连续7 d。
1.2.2 HE染色
造模大鼠喂养7 d后，腹腔注射100 g·L-1水合氯醛麻醉，麻醉完全后迅速取出眼球，在40 g·L-1多聚甲醛中固定充分后进行脱水与透明处理，浸蜡包埋，连续切片、烤片处理后HE染色，光学显微镜下观察各组视网膜组织结构变化。
1.2.3 实时荧光定量PCR法检测Mn-SOD mRNA的表达
大鼠腹腔注射100 g·L-1水合氯醛麻醉，麻醉完全后迅速取出眼球，沿着角巩膜交界处将眼球剪开去除晶状体与玻璃体，完整剥离视网膜，保存于-80 ℃冰箱备用。将完整的视网膜解冻后加入1 mL RNAiso Plus混匀，提取细胞总RNA，按照SYBR GREEN试剂盒进行RT-PCR。Mn-SOD上游引物:ACCCAAAGGAGAGTTGCTG，下游引物：TGTAAGCGACCTTGCTCCT；GAPDH上游引物:AGACAGCCGCATCTTCTTGT，下游引物:CTTGCCGTGGGTAGAGTCAT。将提取的RNA逆转录合成 cDNA，以cDNA产物为模板，进行PCR循环，PCR 循环参数：50 ℃反转录3 min，95 ℃初始PCR活化3 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环40次。扩增后进行熔解曲线分析，采用2-△△Ct法对Mn-SOD mRNA含量进行相对定量分析。
1.2.4 比色法测定SDH水平
按照BCA法蛋白测定说明书准备视网膜匀浆，配液加样后混匀，37 ℃孵育30 min，波长562 nm，酶标仪测定各孔吸光度（A）值。用比色法测定SDH，将可见分光光度计于600 nm处，1 cm光径比色皿，以双蒸水调零，加入待测样本及工作液，混匀并计时，先后读取A值2次（A1值及A2值），求出2次吸光度差值（△A=A1-A2），根据公式计算SDH水平。
1.2.5 酶联免疫吸附法（ELISA）检测COX活性
用纯化的抗体包被微孔板，制成固相载体，往包被COX抗体的微孔中依次加入视网膜标本、标准品、生物素化的抗COX抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色，颜色深浅和样本中COX呈正相关。用酶标仪在450 nm波长下测定A值，计算样本浓度。
1.2.6 免疫组织化学染色法检测Cytc表达
大鼠经不同处理7 d后，腹腔注射100 g·L-1水合氯醛麻醉，取出眼球固定于40 g·L-1多聚甲醛溶液，常规脱水、浸蜡、包埋，制成4 μm石蜡切片后贴片。常规二甲苯脱蜡，梯度洒精脱水，抗原修复，封闭内源性过氧化物酶，滴加Cytc一抗（1∶500），4 ℃孵育过夜后，滴加辣根酶标记的二抗，37 ℃孵育30 min，DAB显色2~5 min，自来水终止显色。苏木素复染后脱水、透明，中性树胶封片，在光学显微镜下随机选取不同的视野观察结果。
1.3 统计学方法
使用SPASS 19.0统计学软件进行处理。实验数据经W检验后用x?±s表示，经levene检验方差齐性，使用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。检验水准：α＝0.05。
2 结果
2.1 低压低氧及RAHC干预对视网膜的影响
在光学显微镜下，常氧组大鼠视网膜各层组织结构清楚（图1A）。低压低氧引起低氧组大鼠视网膜水肿，其中以神经纤维层及内丛状层最为明显，神经节细胞肿胀（图1B）。RAHC干预组神经节细胞肿胀较低氧组减轻（图1C）。
2.2 低压低氧及RAHC干预对视网膜Mn-SOD mRNA表达的影响
低氧组视网膜细胞线粒体Mn-SOD活性［(0.811±0.057)U·mg-1］较常氧组［(0.950±0.920)U·mg-1］低，差异具有统计学意义（P<0.05）；经RAHC干预后，视网膜细胞线粒体Mn-SOD［(0.884±0.101)U·mg-1］活性较低氧组高，差异具有统计学意义（P<0.05），提示RAHC的干预可增强低压低氧环境下视网膜细胞线粒体Mn-SOD的活性。
2.3 低压低氧及RAHC干预对视网膜SDH水平及COX活性的影响
低氧组视网膜细胞线粒体SDH活性较常氧组低（P<0.05），RAHC干预组与低氧组相比，SDH表达无统计学差异（P=0.761）；相较于常氧组视网膜细胞线粒体COX活性，低氧组COX活性下调明显（P<0.01），视网膜细胞有氧代谢程度较弱，而RAHC干预组视网膜受损减轻，COX的相对表达量较低氧组上调，差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。
2.4 低压低氧及RAHC干预对视网膜Cytc表达的影响
免疫组化检测结果显示，常氧组视网膜神经节细胞层、神经纤维层、内丛状层及外丛状层Cytc呈弱阳性表达，低氧组以上各层视网膜Cytc阳性表达增强，而RAHC干预组视网膜Cytc阳性表达较低氧组减弱。见图2。
3 讨论
急性高原环境中，中枢神经系统和呼吸系统功能影响较为明显［5］。急性缺氧会引起中枢神经系统兴奋性增强，视网膜作为神经系统的延伸，也易受急性缺氧的影响。近年来关于急性高原视网膜发病分子水平的研究尚少，为揭示缺氧对视网膜影响的潜在机制，我们前期研究了视网膜中缺氧相关因子和凋亡相关基因的表达［4］，在本研究中进一步探讨低压低氧对视网膜线粒体功能的影响以及RAHC在其中的干预作用机制。
我们在前人相关研究基础上减去四君子汤中的茯苓，加黄芪、玉竹、枸杞而形成本研究中所用的RAHC。研究表明，四君子汤能够抑制自由基损伤，改善机体内分泌功能，调节体内能量代谢［6-7］。其作用机制可能与清除自由基、增强SOD及SDH活性，改善组织抗氧化性，保护细胞线粒体结构的完整性有关［8］。在四君子汤中加入黄芪后，相比四君子汤，大鼠肝脏细胞线粒体SDH和COX活性上调更为明显［9］。玉竹中的成分同异戊酮-1，能够影响线粒体介导的细胞凋亡途径，发挥抗氧化作用［10］。现代药理研究证明，枸杞中含有的枸杞多糖也具有抗凋亡、抗氧化及延缓衰老作用［11］。茯苓归经于心肺脾，主利水渗湿，而易伤津液，因此我们去茯苓，以黄芪人参及白术配伍益气，佐以玉竹养阴，枸杞明目，甘草调和诸药，合用以达益气养阴明目之效。
我们利用低压氧舱模拟5000 m海拔的高原环境，通过观察大鼠视网膜组织形态，发现低氧组处理后的大鼠视网膜出现水肿，神经纤维层水肿最为明显，神经节细胞肿胀，研究提示急性低压低氧环境会导致内源性抗氧化防御系统失衡，抗氧化酶类产生，抗氧化物活性降低［13-15］。我们前期研究表明，低氧会引起视神经脑膜上皮细胞中线粒体、内质网功能障碍，氧化应激能力下降［16］。在RAHC干预下视网膜水肿程度减轻，提示RAHC对急性低压低氧环境导致的视网膜功能受损有一定的保护作用。
SDH和COX作为线粒体的标志酶，其活性强弱反映了细胞有氧代谢活动的程度［17］。COX是线粒体电子传递链的末端酶，而SDH位于线粒体的内膜及嵴，参与三羧酸循环。线粒体ATP的合成与电子传递链密切相关，SDH及NADH脱氢酶氧化的电子沿着ETC传递，与质子泵和整个线粒体内膜的质子梯度相结合，通过ATP合酶受控的质子流向电化学梯度来催化ATP合成［18］。本研究结果表明，急性低压低氧环境会引起视网膜细胞COX及SDH水平和活性下降，且可能进一步导致线粒体的呼吸功能受损，致使氧化代谢不能完成，线粒体中ATP产生中断，从而使视网膜功能受损。RAHC干预后，COX的表达上调，这可能是增强COX活性催化底物氧化，通过ATP合成酶（复合物V）促使ATP合成来完成的［19］。
Cytc作为线粒体呼吸链的重要组成部分，与COX以共价键结合的方式在呼吸链复合酶Ⅲ和IV之间传递电子［20］。我们前期对视神经脑膜上皮细胞研究提示，缺氧应激反应引起视神经脑膜上皮细胞线粒体功能障碍，线粒体膜上形成Cytc释放通道［21］，致使Cytc弥散于细胞质中，对细胞产生不利的影响，诱导细胞凋亡［22］。本研究中，低氧组视网膜神经节细胞层、神经纤维层、内丛状层及外丛状层Cytc表达增强，尤以神经节细胞层最为明显，提示低压低氧环境导致线粒体膜通道开放，上调了Cytc的表达。RAHC干预后，Cytc在视网膜神经节细胞中表达减弱，减轻了视网膜损害程度。
少量的超氧阴离子自由基作为生物体的第二信使，对信号转导有着重要的作用，但过多的自由基不能被及时清理时，会引起一系列氧化损伤［23］。Mn-SOD存在于线粒体基质，是SOD家族中仅有的维持需氧器官生存的必需蛋白［24］，作为视网膜细胞线粒体内主要的抗氧化酶系统之一，Mn-SOD在清理活性氧过程中发挥重要作用［25］。本研究中，急性低压低氧环境引起Mn-SOD活性下降，可能引起超氧阴离子自由基堆积，导致COX及SDH水平下降，使视网膜细胞线粒体结构和功能发生进一步变化，从而影响视网膜功能。RAHC干预后，Mn-SOD活性较低氧组升高，推测RAHC可能与上调Mn-SOD活性、清除视网膜细胞中ROS，保护其免受ROS的损伤有关。
本研究结果表明，急性低压低氧环境影响大鼠视网膜中Mn-SOD、COX、SDH及Cytc活性而对视网膜线粒体功能产生损害，RAHC通过提高视网膜细胞线粒体Mn-SOD、COX水平，降低Cytc活性发挥保护视网膜功能的作用，但其具体作用机制有待进一步研究。