葡萄膜炎主要是由T淋巴细胞介导，涉及虹膜、睫状体和脉络膜的一类自身免疫性疾病［1-3］。研究表明，葡萄膜炎造成了世界上5%~10%人群的视力损害［4］。为探讨人类葡萄膜炎的发病机制，科研人员建立了以大鼠、小鼠为主的实验性自身免疫性葡萄膜炎 (experimental autoimmune uveitis,EAU)动物模型［5］。Yin等［6］研究表明，EAU大鼠眼内炎症明显浸润时，CD4+/CD8+以及Th17/Treg比例明显升高。临床研究表明，与正常对照组相比，葡萄膜炎患者外周血中Th17细胞水平显著增加，Treg细胞水平明显减少，提示Th17/Treg细胞比例失衡可能在葡萄膜炎的病理机制中发挥重要作用［7］。可见，葡萄膜炎的发生发展与免疫系统的平衡紊乱密切相关。
补体是免疫系统的重要组成部分，具有免疫调节功能。研究证实，补体蛋白在调节适应性免疫、桥接先天免疫和适应性免疫中起重要作用［8］。补体系统的紊乱会增加多种自身免疫疾病的患病风险，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus,SLE）、类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis,RA）、血管炎和干燥综合征等［9］。研究发现，经典途径中C1q、C1r、C1s、C2和C4等成分遗传缺陷会增加SLE的患病风险［10］。伴有糜烂性关节炎及严重关节外疾病的RA患者,其血清甘露糖结合凝集素（mannose binding lectin,MBL）水平明显低于非RA患者,血清低水平MBL可能是我国南方人罹患严重RA的危险因素［11］。Zipplies等［12］研究发现，全身或眼组织内iC3b和C3d活化可能与自发性复发性葡萄膜炎发病有关。由此可知，补体系统紊乱会影响自身免疫性疾病的发生发展。
龙胆泻肝汤(Longdan Xiegan decoction,LXD)是传统的中医汤药,药理学研究表明，LXD能调节机体免疫功能，对淋巴细胞及非特异性免疫功能均有一定的正向调节作用。唐凯等［13］研究发现，LXD可通过抑制Th17、Th1等相关炎症因子的表达发挥其在葡萄膜炎中的抗炎作用。但LXD对EAU大鼠发病过程中补体系统的作用机制尚缺乏足够研究。本研究拟从补体通路出发，探讨LXD对葡萄膜炎大鼠血清中C4、MBL2表达的影响，研究LXD在EAU发病机制中的作用，为中药临床治疗葡萄膜炎提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物来源及喂养
6~8周龄体质量160~180 g雌性SPF级Lewis大鼠54只(北京维通利华实验动物有限公司)。实验大鼠饲养于山东中医药大学眼科研究所动物房。实验研究方案、实验动物的使用和喂养过程均得到山东中医药大学眼科研究所实验室动物管理和使用委员会的批准。实验动物的饲养和使用遵循ARVO关于眼科研究动物实验的要求。
1.2 主要试剂及仪器
光感受器间维生素A结合蛋白(interphotoreceptor retinoid-binding protein,IRBP;1177-1191,氨基酸序列:ADGSSWEGVGVVPDV；上海生工生物工程股份有限公司)；结核菌素(tuberculin,TB；美国Difco公司)；完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA；美国Sigma公司)；LXD配方颗粒(产品批号:1311007W；华润三九医药股份有限公司)；Ficoll淋巴细胞分离液(北京Solarbio公司)；大鼠C4、MBL2蛋白酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（武汉基因美生物科技有限公司）；流式细胞仪（美国BD FACSVerse TM公司）；FITC-CD4、PE-CD8（美国eBioscience公司）；激光扫描检眼镜（scanning laser ophthalmoscope,SLO；英国OPTOPROBE SCIENCE LTD公司）。
1.3 动物分组及处理
采用随机数字表法将大鼠分为正常对照组(18只)、EAU组(18只)和LXD干预组(18只)。参照文献［14-15］方法建立EAU大鼠模型,在EAU组和LXD组每只大鼠后肢足垫、两侧腹壁及躯干上皮下注射200 μL含有IRBP和TB的CFA乳糜液;正常对照组大鼠注射等量只含TB的CFA乳糜液。LXD组大鼠自免疫后第一天起，每只大鼠每天给予1000 mg·kg-1 LXD（使用剂量为临床等效剂量折算的5倍）灌胃处理，每天一次，直至大鼠处死。
1.4 大鼠眼底炎症表现及组织病理学检查
免疫后12 d，每组各随机选取3只大鼠使用SLO观察大鼠眼底炎症情况；之后，腹腔注射100 g·L-1 水合氯醛麻醉处死，摘除同侧眼球，立即置于眼球固定液中固定24 h，之后将眼球标本脱水、包埋、切片，行HE染色，观察视网膜病理学变化。
1.5 流式细胞仪检测脾脏和淋巴结中CD4+/CD8+细胞比例变化
取1.4各组大鼠脾脏和淋巴结研磨后分别离心,尼龙毛过滤收集T淋巴细胞,然后用大鼠淋巴细胞分离液进一步纯化得到的T淋巴细胞，并将各组细胞浓度调整为约106个·mL-1。于淋巴细胞中加入FITC-CD4、PE-CD8各1.2 μL，轻轻吹打混匀，然后用锡箔纸将EP管严密包裹,放入4 ℃冰箱避光孵育30 min。染色结束后用40 μm细胞筛网过滤，流式细胞仪检测各组大鼠脾脏和淋巴结中CD4+、CD8+细胞水平，计算二者比值并分析结果。
1.6 ELISA检测大鼠血清中C4、MBL2蛋白的表达水平
3组大鼠分别于免疫后4 d、8 d、12 d、16 d、20 d各随机选取3只行心脏采血（每只3 mL），分离血清，用ELISA试剂盒检测各组大鼠血清中C4、MBL2蛋白的表达水平。
1.7 统计学分析
所有数据均采用SPSS 21.0统计学软件进行分析，所有实验均重复3次并计算平均值，计量资料均以x?±s表示，使用Levene检验方差齐性。统计学差异比较均采用单因素方差分析，各组间两两比较采用LSD检验，检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 大鼠眼底炎症表现
免疫后12 d SLO检查结果显示，正常对照组大鼠屈光间质清晰，视盘边界分明，血管无扩张；EAU组大鼠屈光间质不清，无法观察眼底视网膜及血管情况；LXD组大鼠眼底血管迂曲扩张，屈光间质混浊，视盘边界模糊不清，但较EAU组大鼠症状轻。免疫后12 d组织病理学检查结果显示，正常对照组大鼠眼组织结构排列清晰,无炎性细胞浸润；EAU组大鼠眼组织结构紊乱，视网膜全层破坏，视网膜内可见大量炎性细胞浸润;LXD组大鼠视网膜仅表现为轻、中度炎性细胞浸润。见图1。
2.2 大鼠脾脏、淋巴结中CD4+/CD8+细胞比例变化
与正常对照组大鼠脾脏和淋巴结中CD4+/CD8+细胞比例相比，免疫后12 d的EAU组大鼠脾脏和淋巴结中CD4+/CD8+细胞比值均显著增高，比例失衡，差异均有统计学意义（均为P＜0.01）；LXD组大鼠细胞CD4+细胞水平均降低，CD8+细胞水平均升高，CD4+/CD8+细胞比值逐渐恢复平衡，与EAU组相比差异均有统计学意义（均为P＜0.05），但LXD组脾脏和淋巴结中的CD4+/CD8+细胞比例均仍未恢复至正常水平，与正常对照组相比差异亦均有统计学意义（均为P<0.05）。见图2、图3。
2.3 ELISA检测血清中C4、MBL2蛋白表达水平
ELISA检测结果表明，免疫后EAU组和LXD组血清C4蛋白表达水平逐渐升高，但是EAU组血清C4蛋白水平始终高于LXD组。与正常对照组（0 d）相比，EAU组大鼠免疫后12 d、16 d、20 d血清C4蛋白水平均显著升高，差异均有统计学意义（均为P＜0.01）；与EAU组相比，LXD组免疫后12 d、16 d、20 d 血清C4蛋白水平均明显降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。免疫后EAU组和LXD组血清MBL2蛋白表达水平迅速下降，4 d时达到最小值，然后随时间延长逐渐升高，与正常对照组（0 d）相比，EAU组各时间点血清MBL2蛋白水平均明显降低，而LXD组各时间点血清MBL2蛋白水平均显著高于EAU组，差异均有统计学意义（均为P<0.01）；免疫后16 d、20 d，LXD组血清MBL2蛋白水平与正常对照组相比，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。见图4。
3 讨论
葡萄膜炎是导致人类失明的重要原因之一，但其确切发病机制尚不清楚。目前研究认为，葡萄膜炎发病是眼部免疫监视功能失调、补体系统紊乱的结果［16］。Guo等［17］研究发现，补体系统的活化在葡萄膜炎病理机制中发挥重要作用。C4是补体系统的主要成分之一，与人类自身免疫性疾病的发病相关。临床研究发现，白塞病（Behcet’s disease,BD）缓解期和非BD患者血清C4水平显著低于BD活动期患者［18］。Zhang等［19］研究发现，敲除C4基因的EAU小鼠视网膜炎症严重程度显著低于野生型小鼠，且视网膜中T细胞的浸润减少也表明补体C4 可调节T细胞的免疫应答作用，从而影响T细胞介导的自身免疫性疾病的发展。MBL是聚集蛋白家族的成员之一，由人类10号染色体上的基因编码而成［20］。MBL血清水平与疾病之间的关系相当复杂［21］。低水平的MBL与感染性、自身免疫性和心血管疾病易感性相关。但由于组织损伤可有效激活补体，因此，若自身免疫性疾病和心血管疾病的患者血清MBL含量较高，其临床表现往往更严重［22］。有研究发现，MBL等位基因变异的SLE患者其SLE反复活动发病的可能性较高，并且肾脏受累、动脉血栓形成、反复呼吸道感染风险增加［23-24］。MBL血清浓度较低的RA患者容易形成治疗抵抗，影响疾病治疗进展，并且低水平的MBL与RA早期及进展期的放射性关节损伤相关，表明较高水平的MBL是RA的保护性因素［25］。本课题组前期研究发现，在免疫后的11 d，EAU组大鼠血清C4水平显著升高，同时血清MBL2水平显著降低［17］，提示C4、MBL2的异常表达可能与葡萄膜炎的发生发展有关。但补体系统在葡萄膜炎发病过程中的变化尚不清楚。本研究发现，EAU大鼠血清C4蛋白在免疫后12 d、16 d、20 d显著升高，而血清MBL2蛋白在免疫后各时间点均明显降低，该结果表明，葡萄膜炎的发生发展与免疫性系统紊乱、补体系统失调密切相关。
LXD具有较强的免疫调节作用。研究表明，LXD可显著增强巨噬细胞的吞噬功能，促进淋巴母细胞的转化，提高机体抗炎能力［26］。雷鸣等［27］研究发现，LXD对寻常型银屑病患者的NF-κB蛋白表达有明显抑制作用，从而抑制血清中促炎因子的表达，促进疾病恢复。本研究发现，LXD可有效缓解 EAU 大鼠的前房炎症，减少炎性细胞浸润，保护眼组织超微结构，从而发挥对EAU的治疗作用。总之，LXD可有效降低大鼠CD4+细胞表达水平，提高CD8+细胞表达水平，使两者比值趋于平衡，有效保护EAU大鼠眼组织的超微结构、改善并维持眼局部免疫平衡；此外，LXD还可降低EAU大鼠血清补体C4表达水平，提高MBL2血清表达水平，调节全身补体系统，有助于机体免疫功能的恢复，促进葡萄膜炎的炎症消退。