糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病患者最为常见的眼部微血管并发症，严重者可能会失明［1-2］。临床研究显示［3-4］，DR患者的视网膜组织中存在明显的氧化应激反应，可以诱导局部组织细胞凋亡和损伤。人参皂苷Rg3是从人参中分离出的一种四环三萜类化合物单体，具有很强的抗肿瘤活性，能够抑制肿瘤细胞的增殖［5］。有研究显示［6］，人参皂苷Rg3具有较强的抗氧化作用，能够保护糖尿病肾脏组织。因此，本研究构建DR大鼠模型，研究人参皂苷Rg3对病变组织PI3K-Akt/PKB通路和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、细胞间黏附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）表达的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
亚太参一胶囊（吉林亚泰制药股份有限公司，国药准字Z20030044，规格：Rg3 10 mg/粒）；链脲佐菌素（美国Sigma公司）；SD大鼠135只，体质量210~250 g［北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2017-0022］；TUNEL染色试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）；β-actin、磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K）、丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine kinase，Akt）、p-Akt、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）、VEGF、ICAM-1、B细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma 2，Bcl-2）、Bcl相关X蛋白（Bcl-associated X proteins，Bax）和裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cleaved-Caspase-3）蛋白及蛋白抑制剂（美国Santa Cruz公司）；VEGF、ICAM-1免疫组织化学试剂（美国Thermo公司）；细胞裂解液、ECL化学发光试剂、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；图像采集及图像分析系统（Bio-Rad，美国）；RT-6100酶标分析仪（重庆唯信医疗器械公司）；湿转仪（AB公司，美国）；凝胶成像系统（美国伯乐公司，Gel Doc XR+型）；电泳仪（北京君意东方电泳公司，JY300C型）。
1.2 方法
1.2.1 模型构建
将60只SD大鼠适应性喂养1周，随机分为对照组、模型组、人参皂苷Rg3治疗高剂量组（H-Rg3组）、人参皂苷Rg3治疗低剂量组（L-Rg3组），每组各15只。大鼠禁食12 h，模型组和治疗组大鼠腹腔注射60 mg·kg-1链脲佐菌素，对照组大鼠注射等剂量的柠檬酸缓冲液。注射72 h后尾静脉采血，检测清晨大鼠的血糖水平，两次检测血糖浓度>16.7 mol·L-1，则表明糖尿病模型构建成功。继续观察大鼠，进行眼底镜检测，发现微血管瘤、毛细血管扩张、眼底动/静脉异常，表明DR模型构建成功。造模成功后，H-Rg3组和L-Rg3组大鼠分别腹腔注射5.0 mg·kg-1和0.5 mg·kg-1 Rg3，每天1次，共28 d；模型组和对照组腹腔注射等体积剂量的生理盐水。治疗结束后将大鼠处死，分离其视网膜组织并经多聚甲醛固定后石蜡保存，做成组织切片用于后续实验检测。
1.2.2 视网膜组织中SOD、MDA和LDH检测
取一定量的视网膜组织，匀浆，3000 r·min-1离心15 min，取上清，分别选用黄嘌呤氧化酶法和硫代巴比妥酸法测定SOD和MDA的含量，ELISA检测LDH表达，严格按照试剂盒说明书进行操作。
1.2.3 TUNEL染色
选取各组大鼠视网膜组织切片，按照试剂盒说明要求，进行TUNEL染色检测凋亡细胞，2 h内荧光显微镜下观察结果。凋亡细胞比例=阳性细胞/总细胞×100%。
1.2.4 HE染色
将各组大鼠视网膜组织切片进行HE染色，迅速滴加适量中性树胶，盖玻片封固，显微镜下观察染色情况并分析。
1.2.5 视网膜组织样本蛋白表达检测
取各组大鼠视网膜组织，提取组织总蛋白，酶标仪490 nm波长条件下进行蛋白定量。120 g·L-1 SDS-PAGE电泳分离，采用湿转法将蛋白转至硝酸纤维素膜上，于4 ℃依次加入封闭液孵育2 h，一抗孵育过夜（稀释比例均为1∶1000），二抗孵育2 h（稀释比例均为 1∶5000）。以β-actin为内参蛋白，采用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统检测分析蛋白条带。
1.2.6 免疫组织化学检测
取各组大鼠视网膜组织切片，按照试剂盒说明书操作，进行ICAM-1、VEGF蛋白免疫组织化学染色，依次经二甲苯溶液浸泡后梯度乙醇水合，然后加2滴体积分数3% H2O2-甲醇溶液，孵育10 min，加入血清封闭20 min，用一抗、二抗依次室温孵育30 min，DAB显色、复染、脱水封片，显微镜下观察视网膜组织中蛋白表达。
1.2.7 信号通路验证
将75只SD大鼠随机分为LY-对照组、LY-模型组、LY294002组、LY-Rg3组和LY-Rg3+LY294002组，每组各15只。LY-模型组、LY294002组、LY-Rg3组和LY-Rg3+LY294002组建立大鼠DR模型（方法同1.2.1）。造模成功后，LY294002组和LY-Rg3+LY294002组大鼠静脉注射LY294002（0.5 mg·kg-1），每周1次；LY-Rg3组和LY-Rg3+LY294002组大鼠腹腔注射Rg3（0.5 mg·kg-1），每天1次，注射28 d；LY-模型组和LY-对照组接受等体积的生理盐水腹腔注射。Western blot 检测各组视网膜组织VEGF、ICAM-1、Bcl-2、Bax和cleaved-Caspase-3蛋白的表达。
1.3 统计学分析
采用SPSS 18.0统计学软件分析数据。对于服从正态分布的连续型资料，采用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行多组间比较，若组间比较差异有统计学意义，采用SNK-q检验比较两组间差异，检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 HE染色病理分析
对照组视网膜组织表面光滑，视网膜神经节细胞、内核细胞及外核细胞紧密排列；模型组内外核细胞的单元间隙明显缩小，细胞排列不规则，内在限制膜存在轻微肿胀，表面不光滑；H-Rg3组和L-Rg3组细胞排列较规则，内在限制膜表面较光滑，且随着剂量的增加，病变明显改善。见图1。
2.2 视网膜组织中SOD、MDA和LDH检测结果
与对照组相比，模型组视网膜组织中SOD表达降低（P<0.05），MDA和LDH表达均升高（均为P<0.05）；与模型组相比，H-Rg3组和L-Rg3组SOD表达均升高（均为P<0.05），MDA和LDH表达均降低（均为P<0.05）；与L-Rg3组相比，H-Rg3组SOD表达升高（P<0.05），MDA和LDH表达均降低（均为P<0.05）。见图2。
2.3 TUNEL染色凋亡分析
与对照组相比，模型组视网膜组织中凋亡细胞比例升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表达降低（P<0.05），Bad、cleaved-Caspase-3蛋白表达均升高（均为P<0.05）；与模型组相比，H-Rg3组和L-Rg3组凋亡细胞比例均降低（均为P<0.05），Bcl-2蛋白表达均升高（均为P<0.05），Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表达均降低（均为P<0.05）；与L-Rg3组相比，H-Rg3组凋亡细胞比例降低（P<0.05），Bcl-2蛋白表达升高（P<0.05），Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表达均降低（均为P<0.05），见图3-图4。
2.4 VEGF和ICAM-1蛋白表达分析
与对照组相比，模型组大鼠视网膜组织中VEGF和ICAM-1蛋白表达均升高（均为P<0.05）；与模型组相比，H-Rg3组和L-Rg3组VEGF和ICAM-1蛋白表达均降低（均为P<0.05）；与L-Rg3组相比，H-Rg3组VEGF和ICAM-1蛋白表达均降低（均为P<0.05）。见图5-图6。
2.5 PI3K/Akt/PKB信号通路分析
与对照组相比，模型组大鼠视网膜组织中PI3K和p-Akt蛋白表达均降低（均为P<0.05），Akt蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；与模型组相比，H-Rg3组和L-Rg3组PI3K和p-Akt蛋白表达均升高（均为P<0.05），Akt蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05）；与L-Rg3组相比，H-Rg3组PI3K和p-Akt蛋白表达均升高（均为P<0.05），Akt蛋白表达差异无统计学意义（P>0.05），见图7。
2.6 PI3K/Akt/PKB信号通路验证
与LY-对照组相比，LY-模型组大鼠视网膜组织中VEGF、ICAM-1、Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表达均升高（均为P<0.05），Bcl-2蛋白表达降低（P<0.05）。与LY-模型组相比，LY294002组VEGF、ICAM-1、Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表达均升高（均为P<0.05），Bcl-2蛋白表达降低（P<0.05）；LY-Rg3组VEGF、ICAM-1、Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表达均降低（均为P<0.05），Bcl-2蛋白表达升高（P<0.05）；LY-Rg3+LY294002组VEGF、ICAM-1、Bad、cleaved-Caspase-3和Bcl-2蛋白表达差异均无统计学意义（均为P>0.05）。与L-Rg3组相比，LY-Rg3+LY294002组VEGF、ICAM-1、Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表达均升高（均为P<0.05），Bcl-2蛋白表达降低（P<0.05），见图8。
3 讨论
人参皂苷Rg3是从我国传统中药人参中分离出的皂苷单体，近年来有研究发现［7］，人参皂苷Rg3能够参与机体的代谢过程，具有一定的抗氧化能力，同时能够降低组织中微血管的密度，改善局部血管微循环。本研究中人参皂苷Rg3治疗可以明显改善DR大鼠的视网膜组织病变。有研究显示［8］，高糖会引起机体活性氧大量产生，使组织发生氧化应激反应，与非糖尿病患者相比，DR患者玻璃体内的抗氧化能力显著下降，提示人参皂苷Rg3对视网膜组织病变的保护作用可能与氧化应激反应有关。本研究中，人参皂苷Rg3治疗后SOD表达升高，MDA和LDH表达均降低，均呈现出明显的剂量依赖性。SOD是体内清除氧自由基的主要生物酶，其活力的高低能够间接反映机体消除氧自由基的能力［9］。MDA是脂质代谢的终产物，缺血缺氧造成的氧化应激反应越严重，MDA的表达升高越明显，其浓度水平能够反映机体氧化损伤程度［10］。LDH是细胞损伤的标志，只有当细胞损伤才会由细胞内释放到细胞外［11］，提示人参皂苷Rg3能够降低DR大鼠视网膜组织氧化应激损伤。
本研究中，人参皂苷Rg3治疗后凋亡细胞比例降低，Bcl-2蛋白表达升高，Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表达降低，且表现出显著的剂量依赖性。Caspase家族和Bcl-2家族蛋白为调控细胞凋亡的主要蛋白，当细胞进入凋亡程序，抑凋亡蛋白Bcl-2显著降低，促凋亡蛋白Bad的表达明显升高，进一步放大凋亡信号并刺激下游Caspase-3活化，而凋亡信号一旦激活Caspase-3，细胞凋亡将进入不可逆状态［12］。唐俊等［13］研究表明，氧化应激与内皮细胞功能障碍和细胞凋亡有密切关系，人参皂苷Rg3可以抑制糖尿病肾病大鼠的氧化应激和细胞凋亡，保护肾组织免受损伤，与本研究结果基本相符，提示人参皂苷Rg3可能通过降低DR大鼠氧化应激反应，抑制视网膜组织细胞凋亡。
本研究结果发现，人参皂苷Rg3治疗可以降低DR大鼠视网膜组织中过高的VEGF和ICAM-1蛋白，均呈现出明显的剂量依赖性。有研究发现［14］，VEGF能够增强DR患者视网膜ICAM-1蛋白表达，加强白细胞在视网膜血管的黏附作用，破坏内皮细胞间的连接，引起血-视网膜损伤，并且能够增加血管的通透性，导致纤维蛋白的沉积，进一步促进血管新生，提示人参皂苷Rg3可能通过抑制VEGF和ICAM-1蛋白表达，减轻DR大鼠视网膜组织损伤。PI3-K/Akt/PKB信号通路是细胞内重要的信号传递途径［15］，通过Akt的活化，促进下游mTOR的表达，激活细胞的能量代谢途径促进细胞增殖，同时能够抑制p53蛋白的表达及Bad蛋白活化，抑制细胞凋亡［16］。本研究中，人参皂苷Rg3治疗后大鼠视网膜组织中PI3K和p-Akt蛋白表达明显升高，阻断PI3K/Akt/PKB信号通路后，VEGF和ICAM-1蛋白表达显著升高，细胞凋亡蛋白Bad和cleaved-Caspase-3的表达也显著升高，提示人参皂苷Rg3能够通过激活视网膜组织PI3K/Akt/PKB信号通路，抑制VEGF、ICAM-1、Bad和cleaved-Caspase-3蛋白表达，从而抑制细胞凋亡，保护视网膜组织。
综上所述，人参皂苷Rg3能够通过降低糖尿病视网膜组织的氧化应激反应，激活PI3K/Akt/PKB信号通路，抑制细胞凋亡和VEGF、ICAM-1蛋白表达，改善DR大鼠的视网膜组织。