《眼科新进展》  2019年11期 1087-1090   出版日期:2019-11-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
外泌体及其与眼科疾病的免疫学关系


        外泌体是一种直径为30~150 nm的盘状脂质双层膜小囊泡,是介导细胞-细胞间物质运输、生物分子信息传递的桥梁,其免疫学功能备受研究者青睐。多种眼科疾病的发生、发展及转归均与外泌体有关,部分疾病已被明确证实受外泌体的免疫调控。本文对外泌体进行基本介绍,并总结了关于外泌体与眼科疾病免疫学关系的研究成果,不仅有利于进一步探究外泌体免疫调节作用的分子机制,而且也为外泌体应用于临床眼科工作的前期研究提供了参考资料。
1 外泌体的生物源性及特性
1.1 来源及构成 1983年,Harding等[1]研究发现,绵羊网织红细胞在成熟过程中分泌的小囊泡可以向胞外传递转铁蛋白。1987年,Johnstone等[2]将提取出来的小囊泡首次命名为exosomes(外泌体)。随着对外泌体研究的不断深入,较多研究发现淋巴细胞、树突状细胞、肥大细胞、上皮细胞、肿瘤细胞等多种细胞类型均能分泌外泌体[3-4],并广泛存在于血浆、尿液、乳汁、脑脊液、唾液等生物体液中[5-9]
        基于外泌体内容物的研究一直是该领域的热点。截至目前,已在外泌体中发现9769种蛋白质、3408种mRNA、2838种miRNA(http://www.exocarta.org)。就蛋白质而言,普遍认为外泌体包含的蛋白质按功能可划分为以下4类:参与膜的运输与融合(如Rab家族、Annexins、flotillin);参与多囊泡体的形成(如Alix、TSG101);热休克蛋白家族(如HSC70、HSC90);整合素类与四跨膜蛋白家族(如CD63、CD9、CD81、CD82)。其中部分蛋白质由于在外泌体中发挥作用,丰度明显高于来源细胞,因此可称作外泌体标志蛋白(如Alix、flotillin、CD63、TSG101),并作为分子层面鉴定外泌体的依据。自Valadi等[10]发现外泌体中存在mRNA和miRNA以来,越来越多的RNA在外泌体研究中被发现。不仅如此,针对外泌体中dsDNA[11]和脂质[12]的研究也一直在进行。
1.2 形成及分泌机制 外泌体的产生始于细胞膜内陷,形成早期内吞体,随后早期内吞体通过向内出芽形成含有多个腔内囊泡(intraluminal vesicles,ILV)的成熟内吞体,即多囊泡体(multivesicular body,MVB)。最终在胞内多种分子的作用下,MVB向细胞膜移动并发生融合,ILV被动释放至胞外并形成外泌体[13]
        关于外泌体形成及分泌的分子机制在学界存在争议。大量研究表明,内吞体分选转运复合体(endosomal sorting complex required for transport,ESCRT)、四跨膜蛋白家族、热休克蛋白家族、神经酰胺、Rab家族等[14-18]均可参与以上过程。但对于各种分子所涉及机制的精确描述以及多种机制能否共存于单一细胞中目前尚未明确。
1.3 功能及发挥效应机制 外泌体的主要功能是运送细胞内代谢废物和介导细胞间信号转导[19],针对后者的研究更加广泛。外泌体能够靶向结合受体细胞并调节细胞间通讯,其作用途径主要有以下3种:与受体细胞膜表面受体结合;与受体细胞膜融合;被受体细胞以内吞方式摄取[20]。外泌体可通过呈递新的遗传信息、直接调节信号级联反应等方式影响受体细胞表型与功能[21]。来源细胞和受体细胞的种类及生理、病理状态将共同决定具体的机制和后续的细胞命运。
2 外泌体与免疫学的关系
        近年来日益增多的研究表明,多种来源的外泌体能够有效激活或抑制免疫应答,促进炎症反应,参与肿瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病的发生发展过程,具有十分广泛的免疫学作用[22]。下面将简单阐述外泌体在眼科范畴内发挥的免疫调节作用,并介绍外泌体与免疫学的两种特殊关系:免疫赦免与免疫逃逸。
2.1 免疫调节 大量研究已经证实,外泌体可被多数免疫细胞(T淋巴细胞、B淋巴细胞、树突状细胞、巨噬细胞等)分泌[3],如成熟树突状细胞分泌的外泌体可以激活CD4+T细胞、CD8+T细胞及未成熟的树突状细胞[23],加强免疫反应效果;而巨噬细胞分泌的外泌体下调上皮细胞炎症反应[24]、促进粒细胞迁移的能力[25]也获得共识。不同来源的外泌体也能靶向作用于免疫细胞。最近一项体内实验研究发现,从永生化视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞系ARPE-19中分离出的外泌体,能够调节单核细胞的表型,正常情况下,外泌体能够维持单核细胞的非炎症性稳定形态;而在炎症因子免疫刺激的情况下,ARPE-19来源的外泌体将削弱单核细胞的免疫活性,减少潜在的免疫反应损害[26]。另有研究发现,人RPE细胞分泌的αB-crystallin作为负调节因子影响固有免疫[27],而且外泌体参与这一过程[28]。以上研究证明了源于眼部组织结构的外泌体多呈现免疫负向调节,有利于维持眼内的免疫抑制微环境,这可能与下文提到的眼免疫赦免之间存在关联。
2.2 免疫赦免 眼免疫赦免是指眼局部正常组织能够避免因免疫系统炎性攻击而导致视觉功能丧失的能力。在过去,关于免疫赦免的研究主要围绕胎儿及胎盘。早在上世纪就有报道指出:胎盘分泌的FasL能够通过触发局部母体淋巴细胞的清除,从而达到胎盘免疫赦免的目的[29],Frngsmyr等[30]也证实上述过程。随后,Mckechnie等[31]利用体外实验,进一步证实了生理状态下RPE来源的外泌体能够携带FasL。以上研究成果提示:在血-眼屏障中,外泌体参与的眼免疫赦免可能扮演重要角色,具体的分子机制与胎盘免疫赦免相类似。至于外泌体是否参与了维持眼免疫赦免状态的另一个组成部分——前房相关性免疫偏离,国内外鲜有研究报道。
2.3 免疫逃逸 正常生理状况下,免疫系统能够有效清除体内异常细胞,维持机体稳定。但是已有研究证实,肿瘤细胞能通过外泌体的协助,躲避免疫系统的监控,完成免疫逃逸[32]。多种分子机制在非眼科肿瘤中已被证实,如Huber等[33]研究发现:直肠癌来源的外泌体可利用FasL及TRAIL激活T细胞凋亡通路,发挥免疫逃逸作用;Taylor等[34]研究也表明:从卵巢癌组织分离出的外泌体可以抑制TCR/CD3f及Jak3等细胞信号分子的表达,从而抑制T细胞活性;Mrizak等[35]还发现,在鼻咽癌的发展过程中,外泌体可降低T细胞对IL-2的反应能力,从而导致T细胞分化发生紊乱。另外还有研究表明,肿瘤源性的外泌体可以通过下调NKG2D[36]或抑制穿孔素的表达[37],达到抑制自然杀伤细胞活性、并削弱其细胞毒性的目的。目前,针对眼科肿瘤疾病免疫逃逸的研究相对较少,但其对疾病诊治的重要性不容忽视。有研究已证实,Fas/FasL在视网膜母细胞瘤中较正常视网膜组织高表达[38],这说明在视网膜母细胞瘤生长过程中,可能借助FasL发挥免疫逃逸作用,因此存在外泌体参与其中的可能性。
3 外泌体与眼科疾病的免疫学关联
        诸多眼科疾病的发生以免疫因素为主导,如自身免疫学眼病(如自身免疫性葡萄膜炎)、超敏反应所致眼病(如过敏性结膜炎)等,而免疫因素也在不同程度上影响眼病的发展。下面将以不同层次解剖结构(角结膜、葡萄膜、视网膜)的代表性眼科疾病为例,简述外泌体在其致病和(或)治疗中扮演的免疫学角色。
3.1 角结膜干燥症 角结膜干燥症是指任何原因造成的泪液质和(或)量异常或动力学异常,导致泪膜稳定性下降并伴有眼部不适和(或)眼表组织病变特征的多种疾病的总称,常见的病因包括Sjgren综合征(Sjgren’s syndrome,SS)。SS作为一种慢性全身性自身免疫病,能够使泪腺、唾液腺等多种腺体出现炎性改变及功能紊乱,而泪腺遭到损害即可导致角结膜干燥症。目前尚缺乏对外泌体与SS泪腺损害的直接研究,但已有研究人员发现SS患者体内的唾液腺上皮细胞能够接受B淋巴细胞来源的外泌体,而外泌体所包含的EBV-miR-BART13(一种EB病毒特异性微小RNA)能够通过抑制Ca2+内流通路的激活或者下调水通道蛋白AQP5的方式,影响外分泌腺的液体分泌[39]。另有研究发现,唾液腺上皮细胞分泌的外泌体包含自身抗体Ro/SSA、La/SSB、Sm等,能够激活免疫反应从而造成腺体上皮细胞的损害[40]。泪腺与唾液腺从分子、细胞、组织等各个层次均存在共同点,故可推测上述涉及唾液腺的外泌体研究结论可能也适用于眼组织,但明确定论还需要进一步证实。
        干眼症若持续发展恶化,则出现角膜新生血管的可能性将逐渐提升[41]。这种病理改变的出现往往跟免疫炎症因子的失衡有关。已有研究报道:角膜成纤维细胞来源的外泌体可以向血管内皮细胞运输基质金属蛋白酶14(matrix metallo-proteinase-14,MMP-14),并促进血管生成[42]。因此外泌体中的MMP-14或许能够作为阻止或逆转角膜新生血管的治疗靶点。另外,血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)常常在新生血管形成中起到关键作用。但是,这一作用是否与角膜源性外泌体相关,有待于进一步研究。
3.2 自身免疫性葡萄膜炎 自身免疫性葡萄膜炎是临床常见的致盲性眼病,发病的主要机制是调节性T细胞群失衡[43]。目前临床上主要是运用免疫抑制剂进行治疗,但长期运用容易出现全身性不良反应,并增加青光眼、白内障的发病风险[44]。因此寻求更加安全有效的治疗方式仍是自身免疫性葡萄膜炎研究的关键问题。基于间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)运用于实验性自身免疫性葡萄膜炎(experimental autoimmune uveitis,EAU)模型的前期研究[45],Bai等[46]首次采用MSC分泌的外泌体治疗大鼠EAU,并证实了治疗的有效性。该研究团队发现MSC来源的外泌体能够抑制T细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞等免疫细胞的趋化与浸润,而非直接抑制调节性T细胞的活性。这一发现不仅揭示了MSC免疫抑制功能的机制,也突显了外泌体在眼科疾病治疗中的潜在应用价值。进一步揭示外泌体作用的分子机制将对其今后的临床眼科应用有着不容忽视的重要意义。
3.3 年龄相关性黄斑变性 年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)是导致中老年人视功能严重受损的不可逆性致盲性眼病,其主要病理过程包括:RPE细胞代谢功能障碍、Bruch’s膜断裂、光感受器细胞损伤、脉络膜新生血管形成。在视网膜中,RPE-脉络膜复合体是视网膜外屏障的重要组成部分,其结构、功能的完整对于维持视网膜内环境稳定至关重要。其中,RPE细胞释放的外泌体可以自由穿透RPE-脉络膜毛细血管外屏障,是视网膜内外层细胞-细胞之间的信息及物质传递的桥梁。然而,在不同来源的激活信号(如氧化应激、光损伤等)作用下,RPE细胞来源的外泌体释放量和内容物均发生明显改变[47]。这些具有良好生物相容性的小囊泡可以自由穿透RPE-脉络膜毛细血管外屏障,并释放α-crystal蛋白、CD46、CD59等调节因子[48],它能够活化免疫细胞、激活炎症、促进细胞迁徙、刺激新生血管生成等,并诱发光感受器细胞凋亡[49]。以上现象提示,AMD相关发病过程中外泌体扮演了重要角色。
        趋化因子及受体的生物学作为免疫学的一个分支越来越受到重视。趋化因子受体4(chemokine receptor 4,CXCR4)广泛表达于机体内各类细胞,是趋化因子基质细胞衍生因子-1(stromal derived factor-1,SDF-1)的唯一受体蛋白。两者的特异性结合在免疫激活、炎症趋化、造血调控、胚胎发育等机体内多种生理病理过程中发挥重要作用。既往研究发现,CXCR4在AMD患者的RPE细胞中表达增高[50];而下调CXCR4表达水平可以显著抑制激光诱导的脉络膜新生血管的形成[51]。以上证据表明,在病理条件下,SDF-1/CXCR4通路可以被激活,启动免疫炎症反应并参与调控新生血管的形成。另有研究表明,CXCR4高表达细胞分泌的外泌体可以刺激免疫活化,激活炎症因子,促进血管生成[52];而在特定生理病理状态下,活细胞分泌的外泌体内含有的microRNA可以上调靶细胞CXCR4的表达水平[53]。因此可以推测,SDF-1/CXCR4信号通路和外泌体在促新生血管过程中存在必然联系,这无疑为阐明AMD发病分子机制提供了新的思路。
4 小结
        目前研究表明:外泌体不仅仅参与以上几种眼科疾病,如外泌体参与青光眼发病过程已经在分子水平得到证实[54],但青光眼发展过程中外泌体如何发挥免疫学作用有待更深入的研究。外泌体与白内障、斜视、弱视等其他诸多眼科疾病的免疫学关联尚不确切;对于角膜、眼底新生血管,外泌体凭借哪些信号通路造成影响也缺乏共识。因此,着重于外泌体与眼部疾病发生、发展的分子机制的探讨有着广阔的前景。
        另外,基于外泌体的无细胞治疗逐渐成为热点,诸多研究团队都在积极探索外泌体治疗包含的复杂免疫调节网络。外泌体较细胞而言更加稳定且易于保存,作为眼科疾病免疫学治疗的新型生物产品,它具有很大的临床应用价值,而进一步探讨其安全性是其临床应用的必要前提。