《眼科新进展》  2019年11期 1019-1023   出版日期：2019-11-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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富血小板血浆（PRP）裂解液在苯扎溴胺诱导的小鼠干眼治疗中的作用


        干眼是一种由多种原因引起的眼表组织病变，伴有泪膜渗透压增加，眼表炎症加剧，可引起眼部不适、视觉障碍等，损害角膜和结膜。苯扎溴胺是一种阳离子表面活性剂，能改变细菌细胞膜的通透性，影响细菌的生长代谢，起着较好的杀菌作用。眼用制剂中的苯扎溴胺等抑菌剂能保持滴眼液的稳定性和药物穿透力，提高药效，但过度使用不仅可能降低角膜、结膜上皮细胞屏障功能，而且其去垢作用还会使泪膜被破坏，加速角膜表面的水分蒸发，影响泪液分泌，导致泪膜稳定性下降，引起干眼。
        人富血小板血浆（platelet-rich plasma，PRP）裂解液含有多种促进细胞再生的生长因子，可修复受损眼表，大幅度提升严重干眼的治疗效果。本实验目的在于研究人PRP滴眼液对苯扎溴胺导致的干眼小鼠眼表组织结构的影响与治疗效果，为临床上PRP治疗干眼患者提供一定的理论基础。
1　材料与方法
1.1　实验动物　在室温25 ℃、湿度60%、12 h明暗周期(早上8∶00至晚上8∶00)的条件下，饲养由南昌大学医学院动物中心提供的成年健康BALB/c小鼠36只^［1］，均为雄性，体质量18~21 g。本实验中所有小鼠喂养和研究过程均遵循《实验动物管理条例》，符合动物伦理学要求。
1.2　苯扎溴铵和PRP眼液的制备　制备苯扎溴铵滴眼液（用其制作干眼模型）：将苯扎溴铵稀释于无菌PBS中，制得浓度为1 g·L^-1苯扎溴铵滴眼液，在4 ℃冰箱内保存备用。
        PRP滴眼液的制备：在4 ℃、无菌条件下采集20 mL人静脉血于抗凝管（枸橼酸钠管）中，先将全血离心10 min（转速1500 r·min^-1），离心后把血浆和上层三分之一的血细胞转移至新的无菌管中，初步分离出血浆与血小板。分离后，2500 r·min^-1离心10 min，取5~6 mL无沉淀的上清液冷藏保存^［2］。制备过程不同，所得PRP内生长因子的浓度也会有所不同，其中血小板数量可达到10¹²个·L^-1。
1.3　方法
1.3.1　实验模型及分组　36只小鼠同时用苯扎溴胺滴眼液滴眼，制作动物干眼模型^［2］。将36只干眼模型小鼠随机分为3组（每组12只）：PRP滴眼的A组、PBS滴眼的B组和不作任何处理的模型组。A、B组每天滴眼3次，连续给药2周。在干预前和干预后1周、2周分别对3组小鼠进行基础泪液分泌试验(SchirmerⅠtest，S Ⅰ T)及角膜荧光素染色(fluorescein staining，FL)。
1.3.2　S Ⅰ T检测　将酚红棉线的一端放置在小鼠右眼外眦中外1/3交界处，计时1 min后测量红色部分长度以换算泪液分泌量。该实验应在同一条件（时间、地点、照明亮度、湿度及温度）下由同一人进行相同操作^［3］。
1.3.3　FL染色及评分　角膜FL染色：该实验目的是观察小鼠角膜上皮的受损程度。同样，实验应在同一条件（时间、地点、照明亮度、湿度及温度）下由同一人进行相同操作。评分标准参考文献［3］。
1.3.4　共聚焦显微镜观察　采用Confoscan4裂隙扫描共聚焦显微镜（NidekCi LTD，日本）检查。首先调整小鼠放置支架至合适高度，连接共聚焦显微镜总电源，打开仪器和软件以选择有价值的图像与录像存盘并设置文件夹名称。观察前应先清洁显微镜前表面，在镜头前滴适量的卡波姆凝胶，安装角膜接触帽，转动角膜显微镜，将平面移至角膜接触帽外表面，对好显微镜头，调整焦平面。待小鼠眼表麻醉后，将其头部固定在显微镜前，使其双眼直视正前方，当镜头移动至角膜上皮细胞时，缓慢向前推进，于中央角膜处进行全层扫描并获取图像。观察3组小鼠干预前和干预后角膜上皮基底细胞的炎症反应情况和角膜上皮基底膜下神经的分布，并计算炎症细胞密度。
1.4　统计学方法　采用GraphPad Prism 4.00统计软件进行统计学处理，计量资料以x?±s表示，计数资料用χ²检验；各组治疗前后及不同组间同一时间点的均数比较采用单向方差分析及Dunnett检验。检验水准：α=0.05。
2　结果
2.1　干预前后三组各时段S Ⅰ T和角膜FL染色情况比较　干预前，三组小鼠的S Ⅰ T差异无统计学意义（P>0.05）；干预后1周和2周，模型组和B组S Ⅰ T较干预前有轻微改善，但差异均无统计学意义（均为P>0.05）；而A组S Ⅰ T较干预前有明显改善，且干预1周后，比B组和模型组均有较大改善，差异有统计学意义（P<0.05）。
        干预前，3组FL评分差异无统计学意义（P>0.05）；干预后1周、2周，模型组和B组FL评分较干预前相比有轻微的下降，差异均无统计学意义(均为P>0.05)，而A组FL评分显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。干预后1周、2周，A组与模型组、B组相比，FL评分显著降低，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。见表1。



2.2　3组干预前后角膜上皮基底膜下神经比较　干预前3组角膜上皮基底膜下神经纤维密度、纤维分支数和曲率评分比较，差异均无统计学意义（均为 P＞0.05）。模型组和B组在干预后角膜上皮基底膜下神经纤维密度、神经纤维分支数及曲率评分较干预前变化不大（均为P>0.05)；干预2周后，A组角膜上皮下神经纤维密度较干预前升高（P<0.05)，其他指标无明显变化，且与B组和模型组相比，角膜上皮下神经纤维密度和纤维分支数明显增加，曲率评分显著下降，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结果表明，使用A组滴眼液预防性滴眼可以显著保护角膜上皮下神经，有效减缓干眼炎症对神经的损害。见表2。



2.3　3组干预前后角膜上皮基底细胞中炎症细胞分布情况　正常角膜上皮基底细胞在共聚焦显微镜下胞体较暗，边界较窄。干预前3组角膜可见较多光亮的炎症细胞，3组无明显差异（图1）；干预2周后，模型组（图2A）可见较多光亮的炎症细胞，基底细胞密度稍有减少，而A组（图2B）角膜上皮基底细胞密度明显增加，炎症细胞密度与干预前及B组（图2C）相比明显降低，存在光亮的炎症细胞但数量较少，B组（图2C）可见较多光亮的炎症细胞，角膜基底细胞密度略有减少。细胞计数发现，干预2周后，A组上皮基底细胞和炎症细胞密度与其他两组相比有显著改善，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。结果说明PRP滴眼液的预防处理可以有效控制炎症，控制干眼的进展。见表3。





3　讨论
        PRP是由全血先离心分离出血浆和红血球后，再离心取上清液等方式获取得到的，血小板计数为全血的3倍以上，且含有大量促进细胞修复与再生的生长因子，如血小板源性生长因子（PDGF）、转化生长因子β（TGF-β）、表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）等，并由于PRP的制取不添加任何防腐剂所以安全性较高。随着临床上应用PRP来治疗皮肤溃疡^［1］、膝关节骨性关节炎^［2］等软组织损伤，促进骨髓基质干细胞增殖^［3］、骨折愈合^［4］及修复等骨科和其他方面应用有一定的发展。
        目前，PRP在眼科的研究也逐渐增多，已经被证实可以促进移植后持续性角膜缺损再上皮化^［5］，治疗神经营养性角化病^［6］等。前者在角膜溃疡缺损的治疗过程中，血小板水平起关键性作用；后者由于三叉神经的损伤导致神经肽、神经递质和生长因子缺乏，难以维持眼表的稳态。而干眼则是由于各种因素引起眼表稳态丧失所致的疾病，所以富含生长因子和细胞因子的PRP有着明显的疗效。从我们的研究结果不难发现，PRP对苯扎溴铵所致的干眼有明显的治疗效果，其角膜FL评分明显下降意味着对苯扎溴铵所致的角膜损伤有明显的修复作用，且在很大程度上改善了干眼的相关症状。本结果和其他研究可以得出相同的结论，PRP对于角膜有着极佳的修复作用。Dai等^［7］通过低浓度PRP的研究发现，低浓度PRP对角膜基质细胞的增殖及活化有显著促进作用，这在一定程度上可以解释PRP修复的相关机制。
        临床研究表明，长期使用含苯扎溴铵滴眼液的患者对眼表相关组织和细胞有不同程度损伤^［8］，患干眼的可能性也有不同程度的上升，且随着滴眼液用量的增加，患病率也增加^［9］。PRP在以往取得的研究中被证实有助于干眼时角膜上皮细胞的增殖、迁移和分化，时间越长，含量越高，其促增殖作用越明显，并呈现依赖性^［10］。本实验中，PRP滴眼液较快而明显地改善了苯扎溴胺诱导的小鼠干眼症状，对干眼的治疗达到了较为理想的效果，较好维持了泪液蛋白成分，也改善了干眼导致的泪液分泌量减少。此外，滴用PRP的小鼠角膜上皮下神经纤维密度、纤维分支数和曲率评分的统计结果均明显优于其他两组，且干预2周后，A组炎症细胞数量远少于B组和模型组，而上皮基底细胞密度较B组和模型组明显升高，这意味着，PRP相较于临床上传统的角膜修复类药物有着更广泛的效果，在修复角膜的同时，可以对角膜神经的损伤进行不同程度的修复，且具有一定的抗炎作用。有研究证实，自体PRP治疗干眼的疗效，由于不添加任何防腐剂，该产品耐受性好，患者几乎无不良反应，同时，PRP对细胞培养的炎症模型有更强的增殖和抗炎作用^［11］，这和我们所得的实验结果可以得出相似的结论。由此可见，PRP治疗干眼的高效性、副作用少、用药方式简单已足够表明其具有广泛应用于眼表疾病的价值，尤其在治疗干眼方面具有一定的优势。
        但是，PRP的使用仍存在一定的局限性。由于PRP制备方式并不完全一致，所以PRP在临床治疗时应针对不同疾病选择不同的方式，所得的疗效有所不同，但由于目前缺乏大量临床研究，不同疾病所对应的制备方式尚无统一定论。同时，选择恰当的滴药时间对眼表的恢复也有很大的影响^［12］，有研究表明，损伤炎症期立即使用PRP对组织愈合可发挥最大作用，这意味着PRP的临床应用要求临床医生需要对应用时机有较高的把握能力，且需要大样本的研究确定具体的使用时机及持续治疗时间。
        综上所述，PRP滴眼液滴眼可以防止泪液蛋白随着干眼的进展而恶化，维持泪膜稳定，防止炎症加剧，减缓苯扎溴胺诱导的干眼对神经的损害，控制干眼的进一步发展。