《眼科新进展》  2019年10期 996-1000   出版日期：2019-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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细胞因子对视神经损伤修复作用的研究进展


        创伤、缺血、高眼压、药物中毒、代谢障碍等多种因素均可以造成视神经的不可逆性损伤，由于这些损伤过程机制复杂，尚未完全明了，因此还没有十分有效的治疗方法。细胞因子是一大类低分子多肽或糖肽的统称，它们主要以内分泌和旁分泌的形式分泌，主要功能包括对细胞分化、增殖、存活、凋亡及机体免疫起到调节作用，可由巨噬细胞、淋巴细胞、肥大细胞等免疫细胞所产生，也可由内皮细胞、成纤维细胞、间质细胞等非免疫细胞产生^［1］。视神经损伤后视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells,RGCs）凋亡的主要原因之一是神经营养因子（neurotrophic factors,NTF）的剥夺，NTF能够促进神经元的存活和诱导轴突的生长，对中枢和外周神经系统的组织细胞均具有广泛的生物学活性^［2］。近年来多种研究表明，给予外源性的NTF能够促进视神经损伤后RGCs 的再生和发挥神经保护作用^［3］。目前临床上视神经损伤的治疗方法疗效有限，因此，探索包括NTF在内的细胞因子的治疗价值具有广阔的应用前景。现就眼科研究中主要的几种细胞因子，如睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor,CNIF）、胶质源性神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic flactor,GDNF)、色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor,PEDF)、粒细胞集落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor,G-CSF)、血浆凝血因子(plasma coagulation factor ,F )、促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)等在视神经损伤修复中的作用综述如下。
1　CNIF
        CNIF属于生物活性因子，它广泛分布于神经系统中，对损伤神经具有一定的修复作用^［4］。Cen等^［5］研究了CNIF对巨噬细胞的趋化作用，以及巨噬细胞是否参与了视神经损伤后CNIF相关的RGCs保护和轴突再生的作用。他们制作大鼠视神经横断损伤模型，并用自体周围神经移植的方法促进轴突断端修复。同时进行玻璃体内注射CNIF予以治疗。结果表明玻璃体内注射CNIF能够促进RGCs修复和轴突再生，同时对眼内巨噬细胞能够产生影响。CNIF对血液中的巨噬细胞也具有明显的趋化性。并进一步证明在CNIF参与RGCs保护的过程中，血液来源的巨噬细胞只是被其引导聚集，而没有增殖。CNIF只是一种化学引物，而不是血液来源的巨噬细胞的扩散增强剂。这项研究对理解CNIF的生理功能提供了重要的补充。Yin等^［6］利用玻璃体内注射CNIF和嗅神经鞘细胞的方法促进颅脑损伤导致的视神经离断后远期神经再生。通过比较单独向玻璃体内注射嗅神经鞘细胞或CNIF，以及同时注射两种成分这三种治疗方法对于视神经损伤大鼠的治疗效果，结果发现联合注射CNIF和嗅神经鞘细胞治疗组相对于任一单独治疗组都具有更好的视神经保护效果。Mathews等^［7］又通过实验证明CNIF能够在缺血性视神经病变中发挥RGCs保护作用，提示CNIF可能对非动脉炎性前部缺血性视神经病变具有治疗作用。Jiang等^［8］研究了玻璃体内注射CNIF和胃内注射给予当归白芍光动力复方颗粒的联合治疗效果。利用家兔视神经钳夹伤模型，给予玻璃体内注射一次重组人CNIF治疗，同时从造模后第4天开始给予胃内注射4 g·kg^-1含有当归和白芍的光动力复方颗粒，之后每隔1 d 1次，连续 30 d。利用病理组织学检查和视神经拉伸试验证明，应用光动力复方颗粒和CNIF联合治疗可提升损伤视神经的组织病理学和生物力学水平，联合治疗比单独应用其中任何一种方法都更有效。
2　GDNF
        GDNF也是一种重要的促神经生长因子。Koeberle等^［9］研究发现，在视神经横断伤后向玻璃体内注射GDNF可以延缓RGCs死亡的起始时间，同时提高了损伤后7 d、10 d和14 d存活的RGCs数量。表明GDNF能够提高视神经损伤后RGCs存活率，这一作用可能是通过影响凋亡过程中的重要步骤实现的。但GDNF具体发挥作用的机制仍有待研究。Kilic等^［10］认为GDNF对包括RGCs在内的多种神经细胞具有有效的神经营养作用，它对多种神经退行性疾病具有潜在的治疗作用。他们通过实验发现GDNF可以减少天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶-3阳性细胞的数量，从而认为其视神经保护作用可能是通过调节增强有效跨膜转运实现的。Liu等^［11］研究嗅神经鞘细胞移植联合GDNF玻璃体腔注射治疗对成年大鼠视神经损伤后功能恢复的影响作用。研究者向视神经钳夹伤大鼠的玻璃体内注射GDNF，同时于损伤的视神经处进行嗅神经鞘细胞移植治疗，联合治疗组分别与2种方法单独治疗组效果进行比较。利用视觉诱发电位检查评价各组的治疗效果。结果发现2种方法联合治疗对大鼠视神经损伤模型具有更好的治疗效果。
3　PEDF
        PEDF是由多个片段组成的多肽，具有抗炎、保护神经和抑制新生血管的作用^［12］。Vigneswara等^［13］为证实PEDF对RGCs的保护作用，制作了大鼠视神经横断伤模型，然后分别利用玻璃体内注射PBS、PEDF和cAMP联合PEDF 3种方法治疗 7 d。通过荧光金标记RGCs数量，GAP43抗体检测神经节细胞轴突再生情况，以比较3种治疗方法的疗效。结果表明PEDF能够在视神经离断伤后减少神经节细胞凋亡，增加再生轴突的数量，且联合治疗效果更好。随后Vigeswara等^［14］又通过实验证明了PEDF能够促进视神经损伤后RGCs存活和轴突再生。在实验中他们研究了PEDF中的一个片段，即PEDF-34在体外培养条件下对视神经的保护作用。并比较了通过玻璃体内注射和点眼给药2种治疗方式对视神经损伤动物模型的影响。结果发现动物实验中2种给药方式都起到了促进RGCs再生的作用，而每天通过局部点眼给药的方式给予PEDF-34组比每周玻璃体内注射给药组对RGCs的保护作用效果更好，点眼给药方式通过直接影响视网膜神经元和间接影响视网膜其他细胞促进了轴突再生。因此他们认为PEDF是一种具有促进神经营养和神经保护作用的多功能蛋白。PEDF的活性周期很短，在没有药物缓释系统的情况下往往需要多次眼内注射以保持有效的治疗浓度。然而多次玻璃体内注射有可能引起局部损伤或感染的发生。为了克服这一点，Zhang等^［15］研究了一种基于干细胞的缓释给药系统，以提供PEDF新的治疗途径。他们选取每周给予玻璃体内注射PEDF、每周注射PBS和视网膜下移植基于神经干细胞的眼内缓释PEDF给药系统这3种治疗方式，比较三者对视神经损伤后RGCs的生存和轴突再生的影响。研究者通过Western blot检测治疗2周后3组的PEDF蛋白水平。利用视网膜铺片和免疫组织化学检查治疗2周和4周后RGCs存活和轴突再生情况。发现神经干细胞缓释PEDF组的PEDF水平高于单纯注射组，并且能更为有效地促进RGCs存活和轴突再生。该研究证实视网膜下移植具有PEDF分泌能力的神经干细胞能够维持PEDF处于高浓度水平，干细胞还能分化为神经元细胞和星形胶质细胞，并能够在视神经损伤后显著地提高RGCs的存活率，促进轴突再生。
4　G-CSF
        G-CSF主要作用于骨髓造血系统，能够作用于造血祖细胞，促进粒细胞、单核巨噬细胞成熟，促进这些细胞向外周血的释放^［16］。近来有研究者开始尝试探索其是否具有视神经保护的潜能。Tsai等^［17］研究了G-CSF在大鼠视神经横断伤模型的RGCs退行性变中所起到的作用。他们制作大鼠视神经损伤模型后立即给予皮下注射G-CSF治疗，并与皮下注射PBS的对照组比较疗效。利用荧光金视上丘逆行标记研究RGCs数量，利用闪光视觉诱发电位研究治疗后视功能恢复效果。TUNEL、Western blot检查和免疫组织化学检查视网膜中的磷酸化蛋白激酶B和视神经断端的巨噬细胞标记物ED1的表达。2周后的检查结果表明，G-CSF显著提高了RGCs的细胞密度。闪光视觉诱发电位结果显示G-CSF治疗组具有更好的视功能。TUNEL检查显示G-CSF治疗后的视神经横断伤大鼠视网膜凋亡细胞数量较少。G-CSF治疗后磷酸化蛋白激酶B上调，视神经断端周围ED1阳性细胞数量减少。结果表明G-CSF不仅能够从结构上增加RGCs密度，且闪光视觉诱发电位检查显示其改善了视神经功能。因此研究者认为G-CSF发挥抗神经节细胞凋亡的作用可能是通过影响磷酸化蛋白激酶B信号通路，同时抑制视神经断端周围炎症反应实现的。G-CSF在调控中性粒细胞数量方面发挥着至关重要的作用。而这一功能的发挥是通过G-CSF受体介导的。近来有研究发现这种受体也存在于中枢神经系统中，以往的部分研究也证实了G-CSF可以在视神经损伤动物模型中发挥神经保护作用。然而对其发挥作用的具体机制仍需进一步研究。Frank等^［18］发现在体内外环境中RGCs能够持续分泌G-CSF受体。因此他们认为G-CSF应该能够作为RGCs的神经保护剂。他们发现给予皮下注射G-CSF治疗后能够产生剂量依赖性的视神经保护作用。而在以往研究中多数研究者认为G-CSF是作为干细胞动员的调控因子来发挥神经保护作用的，对其单独应用治疗视神经损伤的潜能认识不足。在给药方式方面，研究者研究了通过玻璃体腔注射和皮下注射G-CSF这两种途径进行治疗的效果。结果表明这两种给药方式都在一定程度上减少了RGCs死亡。这项研究表明G-CSF至少能在一定程度上独立于干细胞发挥治疗作用，这就为临床上将G-CSF作为神经退行性疾病和青光眼等疾病的治疗选择提供了更多证据。Huang等^［19］研究了视神经横断伤后自分泌机制在G-CSF对抗RGCs凋亡过程中所发挥的作用。研究者观察了G-CSF和G-CSF受体在正常大鼠视网膜中的表达情况。免疫荧光染色检查显示G-CSF免疫反应阳性细胞与RGCs、Müller细胞、水平或无长突细胞共同存在。这些结果提示G-CSF在视网膜中是一种内源性配体。半定量RT-PCR检查发现G-CSF及其受体在离断伤后的转录水平发生了上调。同时研究者发现G-CSF具有促进造血干细胞向组织中分化转移以修复损伤的中枢神经细胞的作用。G-CSF可能是通过直接激活固有的G-CSF受体和下游信号通路以启动视网膜中内源性保护性信号通路，从而在视神经损伤后发挥RGCs保护作用的。
5　F
        与哺乳动物不同，鱼类RGCs具有在视神经离断伤后轴突自主修复的能力。在鱼类视神经修复过程中，大量的基因曾被认为与编码修复相关因子有关。利用分子克隆技术，Sugitani等^［20］找到了两种属于谷氨酰胺转移酶家族的cDNA克隆的不规则基因，一种调控F，另一种调控视网膜谷氨酰胺转移酶（glutamine transferase,GGT），这两种基因被认为与视神经修复有关。在视神经损伤后的前2 d RGCs中F的mRNA开始增加，第5-7天达高峰，在视神经损伤后20 d左右回到正常水平。而视网膜GGT mRNA在第5-10天开始增多，第20天左右达峰值，在视神经损伤后40 d逐渐下降。研究者又利用视网膜外植体培养系统研究了重组视网膜谷氨酰胺转移酶蛋白和F对其的影响。结果表明F能够有效促进完整视网膜植片中的神经生长。而GGT只能对视神经损伤5~7 d后受到应激刺激的视网膜产生促进神经再生的作用。因此他们认为F和GGT对视神经损伤后的修复过程具有重要的促进作用。Sugitani等^［21］在之前的研究中从金鱼视网膜中分离出了GGT，并发现在体内外环境中视神经损伤后1-6周的RGCs中GGT的mRNA表达水平升高，且这一过程具有促进视神经损伤修复的作用。为了寻找更多可能发挥修复作用的GGT类型，他们利用特殊的FITC标记底物肽来筛选其他类型的GGT，并评价其对视神经的修复作用。结果发现只有F能够在金鱼视神经损伤后起到促进视神经修复的作用。因此研究者克隆了FA亚族的全长cDNA，并研究在金鱼视神经和视网膜修复过程中FA亚族表达的变化。视神经中的星形胶质细胞和小胶质细胞产生了FA亚族。FA亚族mRNA于视神经横断伤后1 h在视神经断端最先被检测到，并能够在视神经损伤40 d内长期持续的表达。而RGCs中的FA亚族的mRNA和蛋白只在视神经损伤后3~10 d的短时间内有所上调。利用脂质转染法制作的转染有FA亚族的RGCs表现出显著的神经再生作用。RGCs中的 FA 亚族的短暂性增长促进了RGCs断端轴突的再生。由此证明了F具有促进视神经损伤修复的作用。
6　EPO
        近年来EPO被证明在中枢神经损伤后具有神经保护作用^［22］。EPO具有促进神经元有丝分裂以恢复中枢神经系统结构的能力，但其对视神经的神经保护能力和机制尚待研究。Kretz等^［23］比较了成人视神经病变后的RGCs在加入和不加入EPO的体外培养基中的生长情况。结果证明EPO具有对RGCs的神经保护作用和再生能力。King等^［24］评估了EPO在成年大鼠视神经横断伤动物模型中的神经保护能力。研究者在横断伤后立即给予玻璃体内注射EPO治疗。发现注射入玻璃体内的EPO显著促进了眼球和视神经断端之间的RGCs胞体和轴突的再生，同时还促进了眼球后视神经中RGCs轴突的数量增长。因此研究者认为注入体内的EPO既有促进神经再生作用，又有神经保护作用。Wang等^［25］也通过实验研究了重组人EPO在视神经损伤后对轴突再生和神经功能恢复方面的作用。研究者制作大鼠视神经钳夹伤模型，并在损伤后立即给予玻璃体内注射重组人EPO治疗，对照组给予玻璃体内注射生理盐水治疗。通过免疫组织化学检查神经生长相关蛋白43的表达，并用闪光视觉诱发电位检查损伤前、损伤当时、损伤后1周、损伤后2周的视觉电生理情况。结果在正常大鼠视网膜中没有检测到神经生长相关蛋白43，生理盐水对照组的神经生长相关蛋白43表达水平在损伤后1周开始升高，2周后下降。在重组人EPO治疗组，神经生长相关蛋白43的表达水平在损伤后第1周和第2周都处在相对高水平。在损伤后的每个时间点，重组人EPO治疗组中神经生长相关蛋白43的表达均显著高于对照组。闪光视觉诱发电位检查在视神经损伤后能够立即发现明显的变化，这种改变包括P1波的显著延迟和振幅下降。在对照组治疗1周后这种变化依然明显，在第2周，振幅小幅度的恢复到正常值的28.23%。重组人EPO治疗组与对照组相比，在损伤后第1周和第2周恢复程度显著，延迟更接近于正常水平，且振幅在第2周时恢复到正常水平的65.51%。因此研究者认为在视神经损伤后给予重组人EPO治疗能够促进神经生长相关蛋白43的表达，并增加其蛋白浓度，同时视神经的传导速度也显著恢复。所以他们认为重组人EPO具有对损伤视神经的神经保护作用，并能够提高视神经功能。Entezari等^［26］研究了急性外伤性视神经病变患者静脉注射EPO治疗后视功能和色觉的变化情况。对18例在2周内诊断为急性外伤性视神经病变的患者给予连续3 d的每天20 000 IU的EPO静脉注射治疗。于治疗前、治疗后1个月和治疗后3个月进行最佳矫正视力和色觉检查以评价治疗效果，并对3个时间点的结果进行比较。结果表明静脉注射EPO治疗可以显著提高急性外伤性视神经病变患者的最佳矫正视力和色觉。然而长期应用EPO会引起血红细胞增多症。为了减少这种严重的不良反应，Sullivan等^［27］研制了一种在76号基因位点含有一个精氨酸突变为谷氨酸的改良型EPO。在以往的研究中发现这种改良型EPO和广泛使用的普通型具有相同的疗效，同样可以保护视网膜变性和青光眼小鼠模型中的视网膜神经元。然而改良型EPO却没有那么强的促红细胞生成作用，这样就可以在不显著升高红细胞比容的情况下发挥神经保护作用。他们利用小鼠视神经损伤模型，分析不同剂量改良型EPO对小鼠视神经的保护作用。结果发现改良型EPO对RGCs的保护作用表现出剂量依赖性，同时改良型EPO相比于普通型对红细胞比容增长的影响相对较小。Tan等^［28］研究了Rho/ROCK信号通路是否在EPO促进大鼠外伤性视神经病变模型中RGCs轴突再生方面发挥作用。研究者通过实验发现EPO和ROCK抑制剂Y-27632均能显著提高实验动物的RGCs的存活率，促进轴突修复再生。通过免疫组织化学和免疫印迹检查发现，应用EPO和Y-27632均会使RhoA失活、ROCK-1和ROCK-2的表达减少，同时增加神经生长相关蛋白43的表达。EPO在下调活化的RhoA、ROCK-1和ROCK-2表达的同时，有大量的再生轴突出现。因此他们认为Rho/ROCK信号通路参与了EPO促进外伤性视神经病变中RGCs轴突再生的作用。