《眼科新进展》  2019年10期 992-995   出版日期：2019-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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增生性玻璃体视网膜病变中调控上皮间质转化的研究进展


        增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy,PVR）是眼外伤常见的并发症。它能使视力在短期内显著下降，严重影响患者的生活质量。PVR的主要特征是通过创面修复过程形成视网膜前膜，随着前膜的形成和收缩最终使得视网膜皱褶并产生牵引性视网膜脱离，从而导致视力下降甚至失明。手术修复是目前唯一有效的治疗方式，但难以做到视网膜解剖学复位。较高的复发率使得学者们在积极寻找有效的药物辅助治疗途经。研究发现，在视网膜前膜中包含视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium,RPE）细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞和巨噬细胞等多种细胞类型，其中RPE细胞被认为是PVR病理生理过程中的主要参与者^［1］。PVR中RPE细胞经历了一个名为上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）的过程，其中涉及表型转化、细胞外基质（extracellular matrix,ECM）累积和间充质细胞标志物表达等多种改变。研究表明，RPE细胞的EMT过程是PVR发病的关键步骤^［2］。本文将对近年来PVR中调控EMT的研究进展作一综述，以期为研发PVR的辅助治疗药物提供思路。
1　PVR中EMT的简介
        EMT是指上皮细胞在多种细胞因子、生长因子和转录因子的作用下转化为具有间充质细胞表型的生物学过程，在胚胎发育、肿瘤转移和各种纤维化疾病中发挥了重要作用。其主要生物学表现为：上皮细胞中E-钙黏蛋白和波形蛋白表达减少，纤维连接蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）表达增加以及上皮细胞的形态、迁移和增殖等特征向间充质细胞表型转化。在PVR中，视网膜前膜细胞分泌的各种生长因子是EMT的重要推动者，主要包括血小板衍生生长因子、结缔组织生长因子和转化生长因子β（transforming growth factor beta,TGF-β）等。血小板衍生生长因子和结缔组织生长因子可刺激细胞增殖和迁移，而TGF-β能够使伤口闭合、胶原收缩以及细胞形态发生改变。研究发现TGF-β诱导的RPE细胞EMT过程在PVR的发生、发展和转归中起重要作用^［3］。
2　PVR中EMT所涉及的信号通路
2.1　Smad信号通路　TGF-β是一种具有广泛生物活性的细胞因子，包括TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3 3种亚型结构。它可以通过影响细胞增殖、分化和黏附来改变组织的形态。人们最初在乳腺上皮细胞中发现TGF-β可以诱导产生EMT的现象，随后的研究证实，TGF-β在人体多个器官和组织的上皮细胞中均能调节EMT过程，而Smad信号通路在其中扮演了重要角色。Smads家族蛋白按功能可分为膜受体激活型、通用型以及竞争性结合受体型等多种亚型结构。信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中，Smads家族蛋白起到了关键性作用，且不同的Smad蛋白可介导不同TGF-β家族成员的信号传导。Smad3是TGF-β激活素受体下游的一个关键信号转导中间体,通过TGF-β信号可诱导产生血小板衍生生长因子受体，进而能够促进RPE细胞的EMT过程。Saika等^［4］发现，Smad7基因转染人的RPE-19（acute retinal pigment epithelium-19,ARPE-19）细胞系后,可抑制其中TGF-β2/Smad信号传导以及TGF-β1型胶原表达。表明Smad7基因过表达可抑制TGF-β2诱导的ARPE-19细胞纤维化反应。研究人员还发现在Smad3显性失活的细胞中，TGF-β1不能诱导鸟嘌呤核苷酸交换因子的信使核糖核酸(messenger ribonucleicacid,mRNA)和蛋白质表达^［5］。提示Smad3可调节TGF-β1诱导的RPE细胞EMT过程。概括来看，在Smad蛋白介导的TGF-β信号传导中，存在促进和抑制EMT的两种相反作用，而其中具体相互关联的机制仍然有待进一步研究阐明。
2.2　非Smad信号通路　除了典型的Smad信号通路外，还存在多种非Smad信号通路参与了TGF-β诱导的EMT现象。研究人员使用钙离子鳌合剂破坏汇合的ARPE-19细胞，可以发现失去接触抑制的细胞所产生的EMT伴随着经典的Wnt信号通路激活。此外，Chen等^［6］证实，用Notch受体抑制剂阻断Notch途径，并通过转录因子Snail和Slug来抑制Jagged-1表达可以调控TGF-β2诱导的RPE细胞EMT过程。他们还发现除了Smad信号传导途径外，磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase/Akt,PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路也促进TGF-β2诱导的RPE细胞中Jagged-1上调。而Jagged-1的过表达可以模拟TGF-β2诱导的RPE细胞EMT过程。同样有研究显示，在TGF-β1诱导的体外RPE细胞EMT和小鼠PVR模型中，Notch信号通路也扮演着重要角色^［7］。这些数据表明Jagged-1/Notch信号通路参与了TGF-β诱导的RPE细胞EMT过程，且与多条信号通路存在交叉相互作用。除此之外，Ras同源基因家族蛋白A(Ras homolog gene family member A,RhoA)^［5］、细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases1/2,ERK1/2)^［8］以及核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)^［9］等信号通路也参与了TGF-β家族成员介导的RPE细胞EMT过程。在信号通路的调控机制中，针对多条信号通路之间相互关联的信号分子进行靶向调节，将有可能是今后研究控制PVR中EMT过程的热点方向。
3　EMT的增殖作用和纤维化
3.1　EMT与增殖作用　PVR的形成主要包括血-视网膜屏障破坏、细胞增殖以及视网膜前膜纤维化皱缩等几个阶段。相关细胞的增殖和迁移是其发病过程中较为重要的环节。骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein,BMP）是与胚胎期骨骼形成有关的蛋白，能够诱导人体的间充质细胞分化为骨、软骨、韧带和肌腱等组织。有报道其特异性抑制剂能够诱导心肌肥大^［10］。类似地，其拮抗剂可以通过促进细胞增殖作用诱导ARPE-19细胞在体外发生EMT。有研究发现视网膜中表达的BMP还具有抑制视网膜前膜收缩的功能^［11］。这些事实证明BMP的抗增殖作用能够延缓PVR中EMT的进程。另一方面，Chen等^［9］观察到TGF-β1的激酶抑制剂能够通过降低纤维连接蛋白和α-SMA的水平来抑制RPE细胞增殖和迁移，从而阻断TGF-β1诱导RPE细胞的EMT过程。同样，最近有学者发现蛋白酶体抑制剂诱导的蛋白毒性应激也可以抑制RPE细胞增殖和迁移，并起到控制EMT进程的作用^［8］。从这些研究结果来看，寻找到强效的抗增殖药物也许可以逆转RPE细胞的EMT过程，进而为治疗PVR提供新的途径。但是，抗增殖药物也容易产生较为明显的不良反应，尚需要综合多方面因素来考虑其利弊。
3.2　EMT与纤维化　PVR的病理生理过程包括成纤维细胞和肌原纤维蛋白转分化为肌成纤维细胞，肌成纤维细胞产生过量的ECM，并对胞外基质施加牵引力，最终导致组织结构扭曲和功能受损。热休克蛋白47（heat shock protein47,HSP47）是胶原蛋白特异性分子伴侣，其表达增加有助于细胞外基质的累积。研究表明HSP47能够调节TGF-β2诱导的ARPE-19细胞EMT过程^［12］。此外，He等^［13］证实，从人羊膜中纯化的抗瘢痕物质能剂量依赖性的抑制ARPE-19细胞胶原凝胶收缩。总体来看，ECM的累积和收缩将促进EMT过程。另外，研究人员发现与纤维化病变有关的微小核糖核酸(microRNAs,miRNA)在PVR患者的玻璃体中存在显著改变，功能获得的试验提示，玻璃体中miR-21的水平与视网膜纤维化疾病进展呈正相关^［14］。从这些研究来看，受损组织过度修复导致病变部位纤维化贯穿PVR的整个病程。寻找到有效阻止纤维化进程的手段可能有利于控制PVR的发展。
4　EMT的能量代谢和氧化应激
4.1　EMT与能量代谢　最近，Matoba等^［15］发现一磷酸腺苷激活的蛋白激酶［adenosine 5’-monophosphate (AMP)-activated protein kinase,AMPK］对RPE细胞EMT存在一定影响。作为能量代谢调节的关键分子，AMPK的激活剂可以抑制TGF-β2诱导的E-钙黏蛋白下调以及纤维连接蛋白和α-SMA上调。而调节能量代谢的转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体可通过其激动剂来抑制TGF-β信号传导从而调控RPE细胞的纤维化改变。这些研究显示，能量代谢调节积极参与了RPE细胞的EMT过程。另一方面，氨基葡萄糖可通过降低TGF-β受体在RPE细胞表面水平和结合能力来抑制RPE细胞的EMT过程^［16］。与之类似地，研究人员鉴定了RPE细胞EMT时细胞表面聚糖的表达情况，发现RPE集中与半乳糖凝集素-3发生相互作用^［17］。由此看来，体外RPE细胞的EMT可能赋予了糖基化改变。此外，Huang等^［18］研究显示，糖原合成酶激酶-3β（Glycogen synthase kinase-3,GSK-3β）的抑制剂可导致TGF-β1介导的ARPE-19细胞EMT，而GSK-3β过表达可以逆转EMT过程。概括来说，能量代谢失衡可能是触发PVR中EMT过程的重要因素之一，而改善能量代谢的辅助治疗方式也许有助于PVR的预后。
4.2　EMT与氧化应激　研究发现缺氧条件可以激活低氧诱导因子从而调控TGF-β2介导的RPE细胞EMT过程^［19］。在此过程中低氧诱导因子对钠-钾ATP酶具有潜在的调节作用。由此可见，在RPE细胞的EMT过程中，能量代谢和氧化应激存在一定的关联。另外，Ko等^［20］观察到用过氧化氢（H₂O₂）诱导的RPE细胞在三维胶原凝胶中可以发生收缩。进一步研究显示，H₂O₂主要通过诱导p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化来触发EMT过程。还有报道RPE细胞中钙超载能激活钙蛋白酶参与H₂O₂氧化刺激PRE细胞发生的氧化应激改变^［21］。根据这些研究，控制发生氧化应激效应的条件或许在一定程度上可以调控PVR中的EMT过程。
5　EMT与表观遗传
        表观遗传学是指研究没有细胞核DNA序列改变的情况时基因表达水平发生的变化。DNA甲基化、染色质构象改变以及非编码RNA差异表达等均属于表观遗传学的范畴。研究显示，在PVR患者的视网膜中有大量甲基化CpG结合蛋白高表达^［22］，提示DNA甲基化可能参与了PVR的发病过程。另一方面，组蛋白去乙酰化酶的抑制剂可以预防RPE细胞形态学改变和转录因子Snail上调。这些研究可以证明PVR中的EMT受到表观遗传的影响。另外，研究人员鉴定了人类miRNA的表达谱，发现TGF-β2诱导的ARPE-19细胞EMT中有304种miRNA存在差异表达。Jun等^［23］发现过表达miR-124可以改变RPE细胞间的扩散和黏附能力，并以此对抗细胞胶原凝胶收缩。Li等^［24］观察到在ARPE-19细胞中抑制miR-29b可直接触发EMT过程，其主要特征在于细胞形态改变和间充质细胞标志物表达上调。同样，Liu等^［25］发现，TGF-β2在一定范围内以剂量和时间依赖的方式诱导RPE细胞中miR-29b表达降低。有意思的是，Yang等^［26］通过转染小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）实现长链非编码RNA敲除，发现沉默此非编码RNA能够减弱RPE细胞的增殖、迁移和EMT效应。这些研究提示，PVR的EMT过程中存在表观遗传的调控作用，为从基因水平防治PVR提供了一个可行的方向。
6　EMT与中药提取物
        近年来，中药提取物在调控EMT过程的研究也相继被报道。白藜芦醇可以降低视网膜前膜中纤维化膜形成和α-SMA表达。其原理是通过激活去乙酰化酶使smad4去乙酰化，从而抑制TGF-β2诱导的RPE细胞EMT过程^［27］。另外，Zhou等^［28］观察到复方姜黄素在体外能够明显抑制RPE细胞的增殖和EMT过程，其主要是通过p53途径激活G2期关卡来诱导细胞周期停滞，从而发挥抗EMT作用。与此同时，Wang等^［29］发现藏红花酸可以通过抑制p38的磷酸化来减少波形蛋白和α-SMA表达，从而抑制TGF-β2介导的ARPE-19细胞增殖和迁移。从这些研究来看，中药提取物的抗EMT作用主要涉及到表观遗传和细胞周期的调控，但只是在PVR的模型中取得了理想效果。由于PVR的体内和体外模型与临床试验取得的结果有较大差异，使得目前仍没有一种正式应用于临床治疗PVR的药物。最近，Chen等^［30］发现白花丹素能够显著抑制PVR动物模型中EMT的进程而不引起视网膜不良反应。中药提取物的优势在于药物的不良反应可以接受，但仍需要进行大量长期的临床试验来提供验证和保障。