《眼科新进展》  2019年10期 924-928   出版日期：2019-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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miR-101-3p靶向TGFβR1/Smad抑制视网膜母细胞瘤细胞侵袭和迁移


        视网膜母细胞瘤（retinoblastoma,Rb）是一种原发性眼内恶性肿瘤，由13q染色体上的RB1基因功能突变或缺失引起，其典型临床表现为白瞳症及斜视^［1］。Rb占儿童癌症的3％，组织易发生颅内及远处转移，严重威胁患儿生命^［2］。现阶段，临床上多通过静脉化学治疗控制Rb发展及预防转移，肿瘤分化程度低的患者多因Rb眼外转移而死亡^［3］。研究表明，miR-101-3p具有显著的抗癌细胞侵袭及迁移作用，可阻碍非小细胞肺癌、膀胱癌、胃癌等多种癌症的转移^［4］。同时在Rb组织中，miR-101发生显著下调^［5］。miRNA-101-3p是miR-101的亚型之一，关于miR-101-3p在Rb中的作用目前还有待进一步的研究。因此，本文对miR-101-3p在Rb细胞侵袭和迁移中的作用及其机制进行了深入研究，为miR-101-3p的临床应用提供理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　主要试剂　RPMI 1640培养液购自美国Gibco；胎牛血清购自美国Corning公司；青、链霉素购自美国BI；Trizol、荧光素酶报告检测试剂盒、逆转录试剂盒、RT-PCR试剂盒和Lipofectamine 2000转染试剂盒购自美国Thermo Fisher，引物通过Primer 3网站设计，由北京六合华大合成；转化生长因子β受体1（transforming growth factor beta receptor 1，TGFβR1）抗体购自美国Abcam；miR-101-3p mimic质粒、pc-TGFβR1质粒购自上海生工生物工程有限公司；MTT试剂盒、RIPA裂解液及BCA试剂盒购自上海碧云天；Ki67、Bcl-2、Bax、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2、MMP-9、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗体购自美国Santa Cruz；cleaved Caspase-9、磷酸化Smad同源物2（phosphorylated SMAD family member 2，p-Smad2）、p-Smad3抗体购自美国Cell Signaling Technology；实验所用二抗均由上海博士德生物科技公司提供。
1.1.2　组织、细胞及分组　Rb组织及正常视网膜组织由解放军第四一一医院提供，分别采集于15例Rb患者(9例男性，6例女性)和6例死于其他疾病的患者(4例男性，2例女性)。
        Rb细胞株Y79及视网膜色素上皮细胞株ARPE-19由美国典型培养物保藏中心（American type culture collection,ATCC）提供。细胞利用含体积分数10%胎牛血清、100×10³ U·L^-1青霉素和100 mg·L^-1链霉素的RPMI 1640培养液进行培养，培养箱条件为37 ℃、体积分数5%CO₂。传代次日换液，细胞融合率达到85%以上时再进行传代，传代浓度为10×10⁶个·L^-1。
        将Y79细胞随机分为Control组、miR-101-3p mimic组、pcDNA-TGFβR1（pc-TGFβR1）组及miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组。miR-101-3p mimic组转染miR-101-3p mimic，pc-TGFβR1组转染pc-TGFβR1，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组共同转染miR-101-3p mimic及pc-TGFβR1，Control组则加入等量空载。转染6 h后进行以下检测。
1.2　方法
1.2.1　RT-PCR检测　将Rb组织、细胞株Y79、正常视网膜组织、细胞株ARPE-19、经转染miR-101-3p mimic或mimic mock后的Y79细胞及1.2中各组分组处理细胞于通风橱中进行总RNA抽提。定量分析后，取等量RNA反转录为cDNA，最后利用RT-PCR试剂盒对各组cDNA进行定量分析。
1.2.2　荧光素酶报告实验　生物信息学预测miR-101-3p与TGFβR1之间存在连续结合片段。通过PCR扩增将结合片段插入荧光素酶报告载体中，构建TGFβR1 wt质粒；利用基因突变技术对结合片段核苷酸位点进行突变，构建TGFβR1 mut质粒。将miR-101-3p与TGFβR1 wt或TGFβR1 mut共同转染Y79细胞，24 h后检测细胞荧光素酶活性。
1.2.3　MTT检测细胞增殖速率　1.2中各组细胞加入5 g·L^-1 MTT溶液，4 h后终止反应。加入二甲基亚砜低速震荡10 min，充分溶解结晶物后用BIOBASE-EL10A酶联免疫检测仪（山东博科集团）在490 nm处测量各组细胞吸光度值（A值）。
1.2.4　流式细胞术检测细胞凋亡率　1.2中各组细胞加入2.5 g·L^-1胰蛋白酶充分消化，收集细胞用预冷的冷酸盐缓冲液洗涤。将细胞密度调整至10⁹个·L^-1，取100 μL加入试管，再加入Annexin V 5 μL、PI 10 μL避光孵育15 min，通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。
1.2.5　Transwell实验检测细胞侵袭　将Matrigel放于4 ℃预融化，取少量Matrigel到Transwell小室中进行预包被。将1.2中各组细胞接种于Transwell小室，用无血清培养液培养24 h后，棉签拭去上层未迁移细胞，用结晶紫对下层迁移细胞染色并计数。
1.2.6　划痕实验检测细胞迁移　预先于12孔板背面画直线，将1.2中各组细胞接种于板内培养24 h，用10 μL枪头垂直于背面画线进行划痕实验。然后用PBS洗涤以除去被刮下的细胞，无血清培养液培养。分别于0 h和24 h进行取样及拍照，划痕闭合率=(0 h划痕宽度-24 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。
1.2.7　Western blot检测各蛋白表达　RIPA裂解1.2中各组细胞，提取细胞总蛋白，BCA试剂盒对各组细胞总蛋白浓度进行定量并调平。取各组细胞蛋白30 μg，SDS-PAGE将蛋白分离，半干转膜法将蛋白转移至PVDF膜，50 g·L^-1脱脂奶粉室温封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育1 h，曝光显色，以GAPDH为内参，检测TGFβR1、Ki67、Bcl-2、Bax、cleaved Caspase-9、MMP-2、MMP-9、VEGF、p-Smad2及p-Smad3蛋白的表达。
1.3　统计学分析　采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析。首先进行正态分布及方差齐性分析，符合条件的选用单因素方差分析或t检验，不符合条件的选用秩和检验。检验水准：α=0.05。
2　结果
2.1　miR-101-3p在各组织及细胞中的表达　正常视网膜组织miR-101-3p的表达设定为1，Rb中miR-101-3p的表达为0.35±0.05（P<0.01）；视网膜上皮细胞株ARPE-19 miR-101-3p的表达设定为1，Rb细胞株Y79中miR-101-3p的表达为0.24±0.04（P<0.01）。
2.2　miR-101-3p mimic对miR-101-3p及TGFβR1的影响　与Control组比较，mimic mock组miR-101-3p、TGFβR1 mRNA表达差异均无统计学意义（均为P>0.05），miR-101-3p mimic组中miR-101-3p mRNA水平显著升高，TGFβR1 mRNA水平显著降低（均为P<0.01）。见图1。



2.3　miR-101-3p与TGFβR1的靶向关系　生物信息学预测miR-101-3p与TGFβR1之间存在连续结合片段，荧光素酶报告结果示，miR-101-3p mimic可显著降低TGFβR1 wt的荧光素酶活性（图2，P<0.01），而不影响结合片段突变的TGFβR1 mut。
2.4　miR-101-3p mimic对TGFβR1的影响　与Control组比较，miR-101-3p mimic组中TGFβR1的表达水平显著降低，pc-TGFβR1组中TGFβR1的表达水平显著升高（均为P<0.01）；与miR-101-3p mimic组比较，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组中TGFβR1的表达水平显著升高（P<0.01）；与pc-TGFβR1组比较，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组中TGFβR1的表达水平显著降低（P<0.01）。见图3。
2.5　miR-101-3p mimic对Y79细胞增殖的影响　与Control组比较，miR-101-3p mimic组中Rb Y79细胞增殖速率及细胞中Ki67表达均显著降低，pc-TGFβR1组中细胞增殖速率及Ki67表达均显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.01）。与miR-101-3p mimic组比较，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组中细胞增殖速率及Ki67表达均显著升高，差异均有统计学意义（均为P<0.01）。见图4和图5。





2.6　miR-101-3p mimic对Y79细胞凋亡的影响　miR-101-3p mimic组、pc-TGFβR1组的细胞凋亡率分别为（26.81±2.22）%和（4.45±0.89）%，与Control组的（8.63±1.30）%相比，差异均有统计学意义（均为P<0.01）；miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组细胞凋亡率为（13.55±1.67）%，与miR-101-3p mimic组和pc-TGFβR1组相比，差异均具有统计学意义（均为P<0.01）。
        与Control组比较，miR-101-3p mimic组Y79中Bax及cleaved Caspase-9表达显著升高，Bcl-2表达显著降低（均为P<0.01）；pc-TGFβR1组Bax、cleaved Caspase-9表达显著降低，Bcl-2表达显著升高（均为P<0.01）。与miR-101-3p mimic组比较，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组Bax、cleaved Caspase-9表达显著降低，Bcl-2表达显著升高（均为P<0.01）；与pc-TGFβR1组比较，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组Bax、cleaved Caspase-9表达显著升高，Bcl-2表达显著降低（均为P<0.01）。见图5。



2.7　miR-101-3p mimic对Y79细胞侵袭的影响　miR-101-3p mimic组、pc-TGFβR1组，每个视野中侵袭细胞数目分别为（65±11）个、（243±17）个，与Control组的（189±16）个相比，差异均具有统计学意义（均为P<0.01）；miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组视野中侵袭细胞数目为（142±16）个，与miR-101-3p mimic组和pc-TGFβR1组相比，差异均具有统计学意义（均为P<0.01）。
2.8　miR-101-3p mimic对Y79细胞迁移的影响　miR-101-3p mimic组、pc-TGFβR1组细胞划痕闭合率分别为（53.26±6.34）%、（98.34±8.81）%，与Control组的（91.35±8.62）%相比，差异均具有统计学意义（均为P<0.01）；miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组划痕闭合率为（84.16±7.65）%，与miR-101-3p mimic组和pc-TGFβR1组相比，差异均具有统计学意义（均为P<0.01）。
        与Control组比较，miR-101-3p mimic组Y79细胞MMP-2、MMP-9和VEGF表达均显著降低，pc-TGFβR1组中MMP-2、MMP-9和VEGF表达均显著升高（均为P<0.01）。与miR-101-3p mimic组比较，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组中细胞MMP-2、MMP-9和VEGF表达均显著升高（均为P<0.01）；与pc-TGFβR1组比较，miR-101-3p mimic+pc-TGFβR1组中细胞MMP-2、MMP-9和VEGF表达均显著降低（均为P<0.01）。见图6。



2.9　miR-101-3p mimic及pc-TGFβR1对Y79细胞中TGFβR1/Smad通路的影响　与Control组比较，miR-101-3p mimic组中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表达水平均显著降低，pc-TGFβR1组中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表达水平均显著升高（均为P<0.01）。与miR-101-3p mimic组比较，miR-101-3p mimic + pc-TGFβR1组中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表达水平均显著升高（均为P<0.01）；与pc-TGFβR1组比较，miR-101-3p mimic + pc-TGFβR1组中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表达水平均显著降低（均为P<0.01）。见图7。



3　讨论
        Rb是一种极易向颅内及远处转移的原发性眼内恶性肿瘤，阻碍Rb转移可显著提高Rb患者的治愈率。据报道，miR-101在Rb组织中发生显著下调^［6］，而RNA-101-3p是miR-101的亚型之一，提示RNA-101-3p在Rb中的作用机制值得深入研究。因此，本研究通过上调miR-101-3p，对其在Rb中的抗侵袭和迁移作用及其机制进行了深入探究。我们首先检测了miR-101-3p mRNA的表达水平，发现miR-101-3p mRNA表达水平在Rb组织及Y79细胞中均显著降低，提示miR-101-3p下调与Rb发生有关。
        TGFβ/Smad2/3信号通路在Rb中被过度激活，并显著推进Rb的发展^［7］。而TGFβR1是介导TGFβ/Smad2/3信号通路的关键蛋白，在TGFβ诱导的信号转导通路中，TGFβR1被TGFβ磷酸化后进一步活化其底物Smad2及Smad3，放大TGFβ诱导的信号转导效应^［8］。有研究表明，在肝细胞癌中，miR-101与TGFβ受体TGFβR1存在靶向关系，并显著下调TGFβR1^［9］。本研究结果显示，上调miR-101-3p可显著降低Y79细胞中TGFβR1、p-Smad2和p-Smad3的表达；上调TGFβR1可显著减弱miR-101-3p对TGFβ/Smad2/3信号通路的抑制作用。本研究结果表明，miR-101-3p mimic可通过靶向下调TGFβR1抑制TGFβ/Smad2/3信号通路激活，提示miR-101-3p mimic可能通过此机制阻碍Y79细胞侵袭及迁移。
        降低肿瘤细胞的增殖速率并提高细胞凋亡水平可抑制肿瘤组织过度生长。有研究发现，在肺鳞状细胞癌中，miR-101-3p可显著降低癌细胞存活率并提高细胞凋亡水平^［10］。本研究发现，上调miR-101-3p可通过靶向下调TGFβR1抑制Y79细胞增殖并促进细胞凋亡，从而阻碍Rb的发生发展。
        miR-101-3p可显著抑制癌组织的浸润转移，如在膀胱癌细胞中，上调miR-101-3p可显著降低癌细胞的侵袭及迁移能力^［11］。在本研究中，上调miR-101-3p可显著降低Y79细胞划痕闭合率、侵袭细胞数及MMP-2、MMP-9和VEGF表达。上调TGFβR1可显著减弱miR-101-3p的抗侵袭和迁移作用。MMP-2和MMP-9属于MMPs家族，可促进细胞外基质降解，有利于癌组织的浸润转移^［12］。VEGF可显著刺激血管内皮细胞增殖，为肿瘤组织生长转移提供了充分的条件^［13］。因此，miR-101-3p mimic可通过靶向下调TGFβR1抑制Y79细胞侵袭及迁移，从而阻碍Rb的浸润转移。
        综上所述，在Rb组织及Y79细胞中，miR-101-3p mRNA水平显著降低，上调miR-101-3p靶向下调TGFβR1；同时，miR-101-3p mimic靶向下调TGFβR1可显著抑制Y79细胞增殖、侵袭及迁移并促进细胞凋亡的发生，抑制Y79细胞中TGFβ/Smad2/3信号通路激活，提示miR-101-3p mimic可能通过此机制阻碍Y79细胞侵袭及迁移。本研究为寻找Rb有效治疗方法提供了新的思路。