《眼科新进展》  2019年10期 920-923   出版日期:2019-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
两种血管内皮生长因子抑制剂对血管内皮细胞功能的抑制作用比较


        新生血管性眼病是以病理性新生血管异常增生为病变特征的致盲率极高的眼病[1],其中湿性年龄相关性黄斑变性(wet age-related macular degeneration,wAMD)更是导致老年人视力丧失的主要元凶[2]。wAMD的特点是黄斑区脉络膜新生血管形成,非正常的血管增生、渗漏、出血导致黄斑区微结构破坏,最终瘢痕化造成不可逆的视力破坏[3]。近年来,随着lucentis(又名ranibizumab)、avastin(又名bevacizumab)等血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)抑制剂玻璃体内注射的广泛应用,抗VEGF治疗已成为目前最有效的治疗wAMD的手段。
        avastin是一种重组的人类单克隆IgG1抗体,包含了人源抗体的结构区和可结合VEGF的鼠源单抗的互补决定区,能与人VEGF结合并阻断其生物学活性,目前已被广泛应用于抗肿瘤及新生血管性眼病的治疗中[4-5]。虽然抗VEGF治疗为wAMD等视网膜新生血管性眼病提供了有效的治疗办法,但为维持治疗的有效性目前仍需长期重复注射,带来的是安全风险的增加及患者负担的加重。报道过的不良事件包括眼内炎、眼出血、中风和心肌梗塞等[3]。基于此,寻找更安全有效的眼内抗新生血管药物一直是眼科医师追寻的热点。
        tenomodulin(TNMD)是肿瘤坏死因子家族的新成员[6],属于跨膜蛋白类血管生成抑制因子[7]。研究证实,TNMD在体外能抑制血管内皮细胞增生及血管样结构的形成,在体内能抑制肿瘤的发生[8-11]。我们的前期研究证实,TNMD对血管内皮细胞增生有明显抑制作用[12],并能抑制氧诱导视网膜病变小鼠模型新生血管的形成[13]。本研究旨在比较TNMD与avastin对体外培养的血管内皮细胞增生抑制作用的强弱,为寻找更强有力的抗VEGF药物提供实验数据。
1 材料与方法
1.1 材料 TNMD (1 g·L-1,美国Abcam公司)于-20 ℃冷冻保存,在pH 7.4、0.01 mol·L-1磷酸盐缓冲液(PBS)中溶解,溶解后的TNMD 在2~4 ℃环境中可以保存6周。avastin(25 g·L-1,瑞氏罗氏公司)保存在2~8 ℃的环境中,不可冷冻。人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC;KeyGen中国有限公司);VEGF (Biological 中国公司);MTT细胞增殖检测试剂盒(德国Applichem 公司);Matrigel Matrix 生长因子递减基质胶(美国BD公司);DMEM培养基(美国Hyclone公司);体积分数10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、HuMedia EG2培养基(美国Gibco公司)。共焦显微镜(日本Olympus);多功能酶标仪(Themo Multiscan MK3,美国);24孔、96微孔细胞培养板(美国Corning公司)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
 HUVEC为贴壁生长细胞,在含有体积分数10% FBS和100×103 U·L-1 青霉素和链霉素的 HuMedia EG2和DMEM 培养基中生长,置于体积分数5%CO2、37 ℃培养箱中培养,2~3 d更换一次培养基,细胞生长至融合时,用1.25 g·L-1胰蛋白酶乙二胺四乙酸消化,按1∶2比例传代,传代至3~6代的HUVEC共焦显微镜下呈鹅卵石样外观,排列紧密、均匀,保持着血管内皮细胞所具有的基本结构和生物学共性,用于本实验。
1.2.2 细胞增殖实验
1.2.2.1 MTT法筛选VEGF的合适剂量
 将传至3~6代的HUVEC按每孔50×103个接种于96微孔细胞培养板中(每孔100 μL),培养24 h后,置于含体积分数0.5%FBS的培养基中培养6 h,使细胞处于饥饿状态,之后分别加入25 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200.00 μg·L-1的VEGF刺激24 h,每孔加入10 μL 5×103 g·L-1 MTT溶液行MTT染色,孵育4 h,加入150 μL二甲基亚砜并充分混合10 min后,用微板读数器在490 nm处测量吸光度值(A值),检测细胞增殖能力,统计分析得出有促进增殖作用的VEGF剂量A。
1.2.2.2 比较TNMD和avastin对细胞增殖抑制的差异 HUVEC按每孔 50×103个接种于96微孔细胞培养板中(每孔100 μL),培养24 h后,置于含体积分数0.5%的 FBS培养基中6 h,之后分别加入A剂量的VEGF+0.25 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1的TNMD及A剂量的VEGF+0.25 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1的avastin置于孵箱中培养24 h,MTT法检测TNMD和avastin对VEGF诱导的血管内皮细胞增殖抑制的差异。
1.2.3 基质胶体实验 Matrigel Matrix基质胶呈冰冻固态,在冰水中缓慢融化,融化后的基质胶置于 4 ℃ 冰箱中待用。24孔细胞培养板中每孔注入400 μL基质胶,在37 ℃孵箱中放置30 min,Matrigel Matrix由黄色液态变为粉红色胶冻状态。HUVEC在含有体积分数1%FBS的培养基中孵育4 h,胰蛋白酶消化,分别以每孔60×103个细胞接种于粉红色基质胶表面,置于37 ℃孵箱中孵育6 h。实验依据培养基不同分为4组,A组:体积分数1%FBS组作为阳性对照组;B组:体积分数1%FBS+100 μg·L-1 VEGF;C组:体积分数1%FBS+100 μg·L-1 VEGF+2.50 mg·L-1 avastin;D组:体积分数1%FBS+100 μg·L-1 VEGF+10.00 mg·L-1 TNMD。每组设5个复孔,剩余4孔在基质胶表面添加PBS作为阴性对照,同时起到保湿作用。共焦显微镜下观察细胞形态。为量化分析HUVEC毛细血管样结构,各视野随机选择,管型细胞总长度用美国国立研究院NIH 1.61版图像处理和分析软件测量获得,该软件从美国国立卫生研究院公共软件区http://rsb.info.nih.gov/nih-image下载获得。实验进行3次,取其平均值。
1.3 统计学分析 实验数据采用SPSS 13.0统计学分析软件处理,多组间比较使用单因素方差分析,组间的多重比较采用Scheffe multicomparison 检验。检验水准:α=0.05。
2 结果
2.1 MTT法筛选VEGF最优剂量 在含体积分数0.5%FBS低浓度培养基中添加不同浓度的VEGF,设对照HUVEC的A值为1.0,MTT检测结果显示,25 μg·L-1、50 μg·L-1、100 μg·L-1、200 μg·L-1的VEGF相对应A值分别为1.068、1.159、1.184、1.174,差异均有统计学意义(均为P<0.01),100 μg·L-1 VEGF时HUVEC增殖最为显著,后续实验使用此浓度进行。
2.2 TNMD和avastin对HUVEC增殖的抑制作用 100 μg·L-1 VEGF+不同浓度的avastin经MTT染色后显示,设对照HUVEC的A值为1,则单纯添加VEGF的A值为1.163,100 μg·L-1 VEGF+0.25 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1 avastin的A值呈不断下降趋势,分别为1.138、1.122、1.115、1.081;100 μg·L-1 VEGF+0.25 mg·L-1、0.50 mg·L-1、1.00 mg·L-1、2.00 mg·L-1 TNMD的A值分别为1.117、1.095、1.081、1.061,相同浓度下TNMD的A值明显低于avastin的A值,差异均有统计学意义(均为P<0.01),表明TNMD比avastin具有更强的抑制细胞增殖的作用(图1)。



2.3 TNMD和avastin对HUVEC体外血管样结构形成的抑制作用 HUVEC在基质胶表面形成的毛细血管样结构依据培养基的不同而有明显差异,A组:HUVEC在基质胶表面形成毛细血管样结构并相互连接成网状,细胞总长度为(7422±311)μm;B组:毛细血管样结构增多,管状结构长度明显增长,细胞总长度为(9369±121)μm;C组:网状结构稀疏变少,细胞总长度降为(6499±258)μm;D组:毛细血管样结构破坏明显,各视野内管型细胞总长度明显变短,细胞总长度降至(5292±137)μm。4组间细胞总长度差异有统计学意义(F=121.37,P<0.01),两两相比差异均有统计学意义(均为P<0.05)。表明TNMD对HUVEC血管样结构的形成较avastin有更强的抑制作用(图2)。



3 讨论
        虽然lucentis、avastin等抗VEGF药物因其有效性、安全性已成为治疗新生血管性眼病最主要的手段之一,但眼内多次重复注射带来诸多安全隐患并增加了患者的经济负担。目前研究发现,许多具有重要调节功能的新的蛋白类分子具有强有效的抗新生血管作用,能阻断VEGF活性,从而抑制新生血管化的进程[14]
        TNMD是近年在研究肿瘤时发现的对新生血管具有极强抑制作用的蛋白类分子之一,是一种Ⅱ类跨膜糖蛋白,主要在致密少血管的结缔组织,包括肌腱、韧带和眼巩膜、玻璃体、房水中表达[15-16],缺乏TNMD的新生小鼠出现软骨发育迟滞,成年鼠表现为胶原纤维断裂。TNMD存在于细胞表面,其结构上包含一个C-羧基端,与ChM-I前体同源,ChM-I抑制血管形成的功能性领域也正是在这个C-羧基端[10]。有研究表明,TNMD在体外抑制血管内皮细胞的增殖和血管样结构的形成,在体内抑制肿瘤血管的生成而具有相当强的抗肿瘤效果[11]。我们早期的研究也证实,TNMD对血管内皮细胞增生有明显抑制作用[12],并对高氧诱导的缺血性视网膜病变及病理性新生血管的形成有明显的抑制作用[17]
        近年来研究发现,生理状态下,刺激和抑制血管生成受到内源性正向、负向调节因子的调控,其生长和抑制处于一种动态平衡,导致血管的数量、形态、结构保持高度稳定[10]。病理状态下这种动态平衡被打破,其中VEGF是导致血管生成的主要因素,缺氧是促使VEGF高表达的主要原因。阻断VEGF活性能抑制新生血管化的进程。
        本研究通过比较TNMD和avastin两种VEGF抑制剂对VEGF刺激下的HUVEC增殖和毛细管样结构形成的抑制作用,旨在为研究新生血管的发生发展机制及筛选更强有力的新生血管抑制剂提供可靠的实验依据。本研究采用MTT染色法测定细胞增殖,与HUVEC比较,单纯添加VEGF的A值明显上升,但在添加avastin后,随avastin浓度的增加,A值呈不断下降趋势,另外一组添加TNMD的A值也随药物浓度的增加而呈明显下降趋势,且下降速度比添加avastin组更快,经统计学分析,相同药物浓度的TNMD的A值明显低于avastin的A值,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。本研究结果提示,TNMD比avastin具有更强的抑制细胞增殖的作用。本研究利用基质胶体实验对比观察TNMD和avastin对HUVEC体外血管形成的抑制作用。细胞在基质胶表面形成的毛细血管样结构依据培养基的不同而有明显差异,与阳性对照组(A组)比较,添加VEGF组(B组)毛细血管样结构增多,管状结构长度明显增长;添加avastin组(C组)网状结构稀疏变少,细胞总长度下降;添加TNMD组(D组)毛细血管样结构破坏明显,各视野内管型细胞总长度明显变短,本研究结果提示,TNMD对HUVEC血管样结构的形成较avastin有更强的抑制作用。
        本研究结果表明,TNMD作为一种更强有效的VEGF抑制剂,在预防和治疗新生血管性眼病的进程中有巨大的潜力,本实验也为该药用于体内研究提供了一定的实验基础。