《眼科新进展》  2019年10期 915-919   出版日期：2019-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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土槿乙酸对高糖环境下人视网膜微血管内皮细胞表达血管内皮生长因子的影响


        糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见的并发症之一，根据流行病学调查统计显示，糖尿病患者中有1.5%会并发增生型糖尿病视网膜病变（proliferative diabetic retinopathy，PDR）^［1］，其病理学上主要表现为视网膜血管增生、长期反复的眼内出血，最终可引起玻璃体出血和视网膜脱离^［2］。PDR是糖尿病患者视力下降和失明的主要原因。在PDR的发生发展过程中，血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是参与血管生成的主要因素^［3］。有研究发现，在PDR患者的玻璃体和纤维血管组织中，VEGF表达显著增高^［4］。在PDR动物模型中，采用抗VEGF药物抑制其表达后，可在一定程度上改善和延缓PDR^［5］。以上研究表明，VEGF在PDR的发病机制中发挥重要作用。土槿乙酸是从松科植物金钱松中提取出来的一种二萜酸；药理学研究表明，土槿乙酸在抗肿瘤方面具有较强的活性，尤其是能抑制新生血管的生成^［6］。但对于高糖环境下生长的人视网膜微血管内皮细胞（human retinal microvascular endothelial cells，HRMEC），土槿乙酸是否也能抑制VEGF的表达尚不清楚。因此，本研究对该假说开展相关研究，并探索了其潜在的分子机制。
1　材料与方法
1.1　材料　土槿乙酸、兔抗人VEGF抗体（武汉博士德公司）；HRMEC株（中科院细胞库）；FOXO3a磷酸化和非磷酸化抗体（美国Cell Signaling）；鼠抗人抗体、β-actin抗体（Santa Cruz）；细胞RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒以及实时定量PCRMix（北京天根生化科技有限公司）；PCR纯化试剂盒（Qiagen），垂直电泳仪槽、ChemiDoc XRS+化学发光凝胶成像系统（BIO-RAD），LighCycle 480荧光定量PCR仪（Roche），细胞培养箱和生物安全柜（Thermo），多功能酶标仪（Molecular Devices，美国）；BX50倒置荧光显微镜（奥林巴斯）。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养与实验分组　HRMEC采用DMEM培养基于37 ℃、含体积分数5%CO₂恒温细胞培养箱中培养，培养体系中含体积分数10%胎牛血清、青霉素（100×10³ U·L^-1）及链霉素（0.1 g·L^-1）。待HRMEC生长至第3~4代时，根据实验目的分为6组，PL组（低糖空白对照）：葡萄糖浓度为5.5 mmol·L^-1；P0组（土槿乙酸对照组）：在PL组基础上加入8 μmol·L^-1土槿乙酸；PH组（高糖对照组）：葡萄糖浓度为22.0 mol·L^-1；P1组：高糖+2 μmol·L^-1土槿乙酸；P2组：高糖+4 μmol·L^-1土槿乙酸；P3组：高糖+8 μmol·L^-1土槿乙酸。
1.2.2　MTT法检测HRMEC增殖　将HRMEC接种于96孔板中培养过夜后，根据分组的不同给予土槿乙酸处理（每组设立5个复孔），最后加入5 g·L^-1噻唑蓝孵育4 h，经DMSO溶解后，在酶标仪上测定450 nm波长的吸光度（A）值评估HRMEC的增殖。
1.2.3　Western blot检测HRMEC中VEGF表达及FOXO3a磷酸化　收集各组处理后HRMEC，用裂解缓冲液在4 ℃下裂解60 min以提取细胞总蛋白。将蛋白质样品（35 μg）经120 g·L^-1SDS-PAGE处理后，电转印至硝酸纤维素膜上，经封闭后加入相应的一抗4 ℃孵育过夜，充分洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育30 min。最后采用化学发光法显影并检测信号。
1.2.4　实时定量PCR检测VEGF mRNA表达　使用Trizol试剂提取各组处理后HRMEC总RNA。在50 μL反应液中使用1 μg总RNA和随机六聚体进行逆转录反应。使用Primer Express软件设计用于人VEGF mRNA的引物，上游引物：5’-CAAACCTCACCAAAGCCAGC-3’、下游引物：5’-ACGCGAGT-CTGTGTTTTTGC-3’。在LighCycle 480实时定量PCR仪上进行PCR。25 μL PCR反应液含有30 ng cDNA和200 nmol·L^-1引物以及来自试剂盒的其他组分。采用比较阈值循环（CT）方法，通过计算其与管家基因β-actin的比值来确定各组HRMEC中VEGF mRNA相对表达水平。
1.2.5　染色质共沉淀检测FOXO3a与VEGF启动子结合　采用染色质共沉淀检测试剂盒Millipore公司分析FOXO3a与VEGF启动子的结合。各组HRMEC经体积分数1%甲醛交联后，收集于含有10 g·L^-1苯甲基磺酰氟的缓冲液中，加入核酸酶消化后加入3 μg抗FOXO3a抗体或正常家兔IgG孵育，然后用蛋白G琼脂糖珠在4 ℃下温培养过夜以沉淀FOXO3a复合物。65 ℃下加入5 mol·L^-1NaCl和蛋白酶K孵育2 h使DNA-蛋白质解交联。回收样品后用PCR扩增免疫沉淀中的VEGF启动子DNA。FOXO3a引物序列为：上游引物：5’-TCCGGGTTTTATCCCTCTTC-3’、下游引物：5’-TGCTGGTTTCCAAAATCC-3’。
1.2.6　免疫荧光检测FOXO3a核转位　处理后的各组HRMEC在室温下固定于40 g·L^-1多聚甲醛中60 min，1×PBS中轻轻漂洗3次；然后用2.5 g·L^-1 Triton通透后，1×PBS洗涤10 min；室温下加入体积分数3%牛血清白蛋白封闭1 h后，加入FOXO3a抗体室温下孵育1 h，充分洗涤后加入Cy2标记的二级抗体或DAPI，荧光显微镜下拍照并保存。
1.3　统计学方法　所有数据均使用SPSS 17.0软件进行分析，结果用x?±s表示。所有实验至少进行3次，组间比较采用Student’s t检验或双向方差分析。检验水准：α=0.05。
2　结果
2.1　土槿乙酸对高糖条件下HRMEC增殖的影响　各组HRMEC分别培养12 h、24 h和36 h后，MTT检测结果显示，在相同的时间点，PH组HRMEC增殖率明显高于PL组，并且随着时间的延长，细胞增殖率逐渐增高（均为P<0.05）；P0组中HRMEC增殖率仅轻微降低，而经不同浓度土槿乙酸处理后的P1、P2和P3组HRMEC增殖率与PH组相比，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）；此外，在同一时间点P1组、P2组、P3组中HRMEC增殖率相比，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。见表1。
2.2　土槿乙酸对体外培养的HRMEC中VEGF mRNA和蛋白表达的影响　不同处理组HRMEC培养24 h后，实时定量PCR检测结果显示，PL组和P0组HRMEC中VEGF mRNA表达差异无统计学意义（P>0.05）；与PL组相比，PH组VEGF mRNA表达有所增高（P<0.05，图1）；而P1组、P2组、P3组中VEGF mRNA明显低于PH组。此外，Western blot检测结果也显示，P1组、P2组、P3组VEGF蛋白表达均明显低于PH组（图2）。





2.3　土槿乙酸对体外培养的HRMEC中FOXO3a和VEGF启动子结合的影响　染色质共沉淀结果显示，PL组中FOXO3a和VEGF的结合水平较高，PH组中FOXO3a和VEGF的结合水平低于PL组，而经不同浓度土槿乙酸处理后，FOXO3a-DNA复合体的水平明显增多（图3）。
2.4　土槿乙酸对体外培养的HRMEC中FOXO3a磷酸化和核转位的影响　Western blot检测结果显示，PL组和P0组HRMEC中FOXO3a第253位丝氨酸（Ser253）磷酸化水平较低，PH组均有不同程度的增高。而P1组、P2组、P3组随着土槿乙酸浓度的增加，Ser253磷酸化水平随之减少（图4）。免疫荧光结果也显示，PL组HRMEC中FOXO3a在细胞核内含量较多，而在PH组细胞浆中FOXO3a明显增多。P0组以及P1组、P2组、P3组中细胞核内FOXO3a明显增多（图5）。





3　讨论
        血管内皮细胞是维持血-视网膜屏障功能完整性不可缺少的组织结构。糖尿病患者由于高血糖长期持续存在，可诱导微血管内皮细胞增殖以及血管新生。但高糖对不同来源的血管内皮细胞的影响有所不同，如对大血管内皮细胞的影响主要表现为抑制其生长，而对微血管内皮细胞而言其增殖反而增强^［7］。本研究采用MTT法检测了高糖（22.0 mmol·L^-1）环境下对HRMEC增殖的影响，结果发现：高糖条件下，随着孵育时间的延长，HRMEC增殖率逐渐增高。相同的时间点，PH组细胞增殖率明显高于PL组；而经不同浓度土槿乙酸处理后，细胞增殖率有所降低；说明高糖环境下对HRMEC增殖具有促进作用，而土槿乙酸可有效抑制其增殖水平。
        有研究表明，VEGF是参与PDR发生发展的重要分子，在PDR患者的玻璃体样本中，其表达水平也明显高于非糖尿病患者^［3］。此外，高血糖和氧化应激以及非感染性炎症反应也能增加VEGF的表达水平^［5］。VEGF通过与其受体介导结合后，可激活下游级联信号，包括PI3K/Akt、p38和Raf等途径，从而调控内皮细胞生长、增殖和血管化生。本研究中Western blot检测结果显示，PL组HRMEC仅表达少量VEGF，而PH组HRMEC中VEGF表达显著增高，这表明一定浓度范围内，高糖环境可以促进HRMEC增殖并上调VEGF表达，与文献报道相符^［7］。既然高糖环境能促进HRMEC增殖并上调VEGF表达，那么采用药物干预逆转该效应，理论上应该能改善或延缓PDR的发生发展。土槿乙酸是一种重要的双萜类化合物，其在抗新生血管生成方面作用已经得到了证实。有研究发现，土槿乙酸可影响HIF-1α和VEGF的分泌而抑制小鼠体内新生血管的生成^［8］。本研究采用不同浓度土槿乙酸作用高糖培养HRMEC后发现，细胞的活性受到抑制；随后的Western blot检测也发现，土槿乙酸处理也能下调HRMEC中VEGF mRNA和蛋白表达水平，说明土槿乙酸抑制体外HRMEC的增殖可能与下调VEGF的表达有关。
        叉头框蛋白（forkhead box protein，FOX）是参与细胞增殖分化的一类蛋白家族，其中以FOXO3a最重要，参与多种与细胞生长增殖相关基因的表达^［9］。FOXO3a转录调节因子的活性主要受磷酸化/去磷酸化调节^［10-11］。FOXO3a第253位丝氨酸残基（Ser253）是决定其激活并核定位的关键^［12］。本研究通过免疫荧光实验也证实，HRMEC在静息状态下，FOXO3a主要位于细胞浆内，Ser253呈明显磷酸化状态。而土槿乙酸处理后，可有效抑制Ser523磷酸化，并增加细胞核内FOXO3a水平，表明土槿乙酸可诱导FOXO3a核转位。VEGF启动子上游含有核转录因子FOXO3a的结合位点，因此VEGF的分泌也受FOXO3a的负向调控^［13］。为进一步明确土槿乙酸对FOXO3a和VEGF启动子结合的影响，我们采用染色质共沉淀技术观察了土槿乙酸处理前后HRMEC中FOXO3a与VEGF启动子结合情况。结果显示，土槿乙酸处理后FOXO3a和VEGF的结合水平明显增高，表明土槿乙酸是通过激活FOXO3a，最终结合至VEGF启动子上而发挥负向调控作用的。
        综上所述，本实验证实土槿乙酸能够抑制高糖培养条件下HRMEC的增殖，并能抑制HRMEC中VEGF的表达，其机制可能与激活核转录因子FOXO3有关。但本研究仅仅为体外实验，并且只考虑了VEGF，事实上PDR发病机制复杂，多种发病机制相互影响，加之VEGF也受多重信号通路调控，因此以上问题仍需要进一步研究。