《眼科新进展》
2019年10期
911-915
出版日期：
2019-10-05
ISSN:
1003-5141
CN:
41-1105/R
重组碱性成纤维细胞生长因子通过Notch1信号通路对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞的保护作用
视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）轴突形成视神经，为仅有的视觉信息传递元件，RGC受损是糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的重要原因
［1］
。因此，通过改善受损的RGC甚至促进其再生可预防和治疗DR
［2］
。重组碱性成纤维细胞生长因子(recombinant basic fibroblast growth factor,rbFGF)是一类新的神经营养因子，可促进神经元存活及再生
［3］
。视神经受损后玻璃体内给予rbFGF有助于RGC的存活，可促进RGC功能修复
［4］
。Notch1信号与神经元受损后修复及再生密切相关
［5］
，而Notch1在DR状态下对RGC的影响尚未完全清楚。因此，本研究探讨rbFGF对DR状态下RGC的影响，为其对DR发病机制的研究提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 动物分组及模型制备
雄性SD大鼠40只，体质量200~220 g［购自锦州医科大学，SCXK(辽)2014-16］。随机分成对照组、糖尿病组、rbFGF组、rbFGF+DAPT组，每组各10只。后三组采用单次腹腔注射55 mg·kg
-1
链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)，72 h后检测尾静脉血糖，血糖浓度＞16.7 mmol·L
-1
的大鼠为糖尿病模型造模成功。模型诱导成功后，依据文献，rbFGF组给予rbFGF 10 μL(200 U)玻璃体内注射给药(双侧眼球均给药)
［6］
，rbFGF+DAPT组在给予rbFGF基础上加用DAPT(10 μmol·L
-1
)
［7］
。对照组、糖尿病组注射等量PBS缓冲液。12周后进行各项指标检测。
1.1.2 主要试剂及仪器
STZ(美国Sigma公司)；重组人bFGF(珠海亿胜生物制药有限公司)；DAPT、GAP-43、Notch1、Caspase-3及β-Tubulin抗体 (英国Abcam公司)；荧光及Western blot二抗(北京碧云天公司)；血糖仪(美国强生公司)；荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)；冰冻切片机(德国SLEE公司)；水平电泳仪(美国BIO-RAD公司)。
1.2 方法
1.2.1 样本制备
12周后，每组取5只大鼠，40 g·L
-1
多聚甲醛灌注取出眼球，300 g·L
-1
蔗糖溶液脱水，OCT包埋后切片，厚度为10 μm，4 ℃保存，备用。每组另取5只大鼠分离视网膜，裂解，冰上剪碎，4 ℃离心30 min后取上清，-20 ℃保存用于Western blot检测。
1.2.2 HE染色检测RGC密度
切片浸于PBS中洗3次，每次3 min；滴加苏木素2 min后浸于PBS中1 min，自来水冲洗；体积分数95%酒精脱水1 min，伊红浸染2 min，自来水冲洗；脱水透明后封片，显微镜下观察。应用Image J 软件计数RGC数量并换算成密度。
1.2.3 免疫荧光染色检测大鼠视网膜GAP-43蛋白表达
PBS洗切片3次，每次3 min；体积分数3%山羊血清+体积分数0.3% TritonX-100室温孵育 1 h，不洗；滴加兔抗大鼠GAP-43 (1∶800)，4 ℃过夜，PBS洗4次，每次3 min；滴加山羊抗兔A488，室温 1 h，PBS洗4次，每次3 min；封片后荧光显微镜下观察。
1.2.4 免疫组织化学检测大鼠视网膜Notch1蛋白表达
PBS洗切片3次，每次5 min；体积分数3％H
2
O
2
室温封闭10 min，PBS洗3次，每次3 min；体积分数3%山羊血清室温孵育30 min，不洗；滴加兔抗大鼠Notch1 (1∶500)，4 ℃过夜，PBS洗3次，每次3 min；滴加二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG），室温30 min，PBS洗3次，每次3 min；滴加SABC试剂，室温30 min，PBS洗3次，每次3 min；DAB显色，复染、脱水、透明封片后荧光显微镜下拍照，并应用Image J软件分析Notch1表达阳性率。
1.2.5 Western blot检测大鼠视网膜GAP-43、Notch1、Caspase-3蛋白相对表达量
BCA法测定蛋白浓度，确定电泳时加入15 μL样品；电泳、转膜后10 g·L
-1
BSA室温封闭2 h；加入一抗(兔抗大鼠GAP-43，1∶2000；兔抗大鼠Notch1，1∶5000；兔抗大鼠Caspase-3，1∶5000)，4 ℃孵育过夜，TBST洗4次，每次5 min；加入二抗［山羊抗兔IgG（H+L）］室温2 h，孵育后TBST洗4次，每次5 min；电化学发光法(electro-chemiluminescence,ECL)显影，Image J软件分析灰度值。
1.3 统计学方法
采用SPSS 20.0统计软件进行分析，整体比较采用F检验，两两比较采用LSD检验，所有数值均以均数±标准差表示，检验水准：α=0.05。
2 结果
2.1 HE染色检测RGC密度
四组之间整体比较差异有统计学意义(F=405.63，P<0.05)。与对照组相比，糖尿病组及rbFGF+DAPT组RGC密度均明显降低(均为P<0.05)，rbFGF组和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与糖尿病组相比，rbFGF组RGC密度明显增加(P<0.05)，而rbFGF+DAPT组和糖尿病组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与rbFGF组相比，rbFGF+DAPT组RGC密度明显降低(P<0.05，见表1、图1)。
2.2 免疫荧光染色检测GAP-43蛋白表达
将对照组GAP-43蛋白免疫荧光强度设定为100.00%，荧光强度分析结果显示：四组之间整体比较差异有统计学意义(F=2052.27，P<0.05)；与对照组相比，糖尿病组、rbFGF组及rbFGF+DAPT组GAP-43蛋白表达均增加(均为P<0.05)；与糖尿病组相比，rbFGF组GAP-43蛋白表达明显增加(P<0.05)，而rbFGF+DAPT组和糖尿病组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与rbFGF组相比，rbFGF+DAPT组GAP-43蛋白表达明显降低(P<0.05，见表1、图2)。
2.3 免疫组织化学检测Notch1蛋白表达
应用Image J软件分析Notch1蛋白表达阳性率，结果显示：四组之间整体比较差异有统计学意义(F=1403.75，P<0.05)。与对照组相比，糖尿病组及rbFGF+DAPT组Notch1蛋白表达均明显降低(均为P<0.05)，rbFGF组和对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；与糖尿病组相比，rbFGF组Notch1蛋白表达明显增加(P<0.05)，而rbFGF+DAPT组和糖尿病组比较差异均无统计学意义(均为P>0.05)，与rbFGF组相比，rbFGF+DAPT组Notch1蛋白表达明显降低(P<0.05)，见表1和图3。
2.4 Western blot 检测GAP-43、Notch1、Caspase-3蛋白相对表达量
四组之间整体比较，GAP-43、Notch1、Caspase-3蛋白相对表达量总体差异均有统计学意义(F=3092.92、899.56、1788.46，均为P<0.05)。与对照组相比，糖尿病组、rbFGF组及rbFGF+DAPT组GAP-43蛋白相对表达量均增加(均为P<0.05)，糖尿病组及rbFGF+DAPT组Caspase-3蛋白相对表达量增加，Notch1蛋白相对表达量明显降低(均为P<0.05)，rbFGF组和对照组Notch1及Caspase-3蛋白相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)；与糖尿病组相比，rbFGF组GAP-43蛋白相对表达量、Notch1蛋白相对表达量明显增加，Caspase-3蛋白相对表达量明显降低(均为 P<0.05)，而 rbFGF+DAPT组和糖尿病组GAP-43、Notch1、Caspase-3蛋白相对表达量差异均无统计学意义(均为P>0.05)；与rbFGF组相比，rbFGF+DAPT组GAP-43、Notch1蛋白相对表达量明显下降，Caspase-3蛋白相对表达量明显增加(均为P<0.05)，见表2和图4。
3 讨论
DR患者与日俱增，发病机制复杂，除了大家公认的血管性损伤外，神经功能障碍近年来也被学术界广泛关注
［8-9］
。RGC轴突构成了视神经的主体，在DR发生发展过程中出现RGC胞体萎缩、数目减少及凋亡等重要改变，因此，通过保护损伤的RGC甚至促进其再生可预防和治疗DR
［2］
。有研究发现
［10］
，在DR模型中，RGC胞体肿胀，并出现大量空泡样变，RGC数量减少18.6 %，并证明 RGC发生了明显凋亡。本研究发现，与对照组相比，糖尿病组GAP-43蛋白表达反应性增加，但却不足以抵抗RGC密度的下降及凋亡的增加，因此如何上调GAP-43蛋白的表达及促进RGC修复再生成为众多研究者探讨的方向
［11］
。
RGC为神经元，损伤后难以再生。神经修复受到抑制的原因包括神经生长因子的匮乏、蛋白表达的抑制等
［12-13］
。轴突损伤后，多种基因表达异常、神经营养因子缺乏最终导致神经元死亡。rbFGF是一类新的神经营养因子，可促进神经元存活及再生。研究发现，rbFGF还可以增加新生大鼠视网膜RGC存活率
［14］
。本研究发现，在STZ诱导的糖尿病大鼠成模后给予玻璃体内注射rbFGF进行预防性治疗，与糖尿病组相比，rbFGF组GAP-43蛋白表达明显增加，Caspase-3蛋白表达明显下降，RGC密度明显增加。因此，rbFGF对DR状态下RGC的损伤具有保护作用。
Notch1信号可调节神经元生长，与神经元受损后的修复及再生密切相关
［5］
。通过激活Notch1信号，有助于周围神经元再生
［15］
。本研究发现，与对照组相比，糖尿病组Notch1蛋白表达明显下降，提示DR损伤会造成Notch1通路的抑制。而对糖尿病大鼠给予玻璃体内注射rbFGF进行预防性治疗后，Notch1被激活，蛋白表达明显增加，而同时伴随着GAP-43蛋白表达明显增加，Caspase-3蛋白表达明显下降，RGC密度明显增加。该结果提示，rbFGF可能通过激活Notch1通路，进而促进RGC再生，减少其凋亡，对RGC起到保护作用。为进一步验证该结果的准确性，在给予rbFGF基础上，同时给予Notch1通路抑制剂DAPT，结果发现DAPT几乎逆转了rbFGF对RGC的保护作用。因此，该结果可以证实，rbFGF 主要通过激活Notch1信号通路保护受损的RGC。
综上所述，本研究发现rbFGF上调DR状态下视网膜中GAP-43蛋白表达，下调Caspase-3蛋白表达，进而提高RGC的存活，其机制与激活Notch1信号通路有关。但因DR致病机制复杂，rbFGF的临床价值仍需进一步深入探讨。