《眼科新进展》  2019年10期 906-910   出版日期:2019-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
人工角膜载体的体外构建及生物相容性研究


        全世界超过1000万人正承受着角膜盲的痛苦[1],目前角膜移植存在的一个主要问题就是供体短缺。而创建组织工程角膜却极具挑战性,因为它不仅需要构建膜性载体,还要保证其透明性、机械稳定性和生物相容性。为了解决这些难题,研究人员开始尝试把各类与角膜成分相似的生物材料用于人工角膜载体的合成,而载体所形成的三维结构不仅要能为细胞代谢、获取营养和生长提供有利空间,也为植入的细胞最终形成相应的组织或器官提供良好的微环境[1]。本研究选用天然材料中的蚕丝蛋白(silk fibroin,SF)和贝壳中提取的壳聚糖(chitosan,CS)作为原料。SF可以从家蚕的茧中大量提纯其丝素[2-3],被广泛应用于各种组织工程材料中,如运药载体胶囊[2]、关节骨科及韧带的结缔组织替代物[4]等。CS是一种甲壳素衍生材料,因其独特的黏弹性被广泛用于药物载体和眼科实践中[5]。因此,本研究应用SF和CS共同制成载体膜片,用其构建组织工程角膜基质并评估该膜的各项生物特性,进一步研究不同比例SF和CS共混膜片的物理特性。
1 材料与方法
1.1 材料 清洁级成年新西兰白兔33只(哈尔滨医科大学附属第一医院实验动物中心提供),体质量1.5~2.0 kg,饲养温度(22±2)℃,湿度40%~70%,自然光照,自由进食与饮水。用于角膜移植及细胞培养。蚕丝原料由浙江嘉兴丝绸有限公司赠送;高脱乙酰度壳聚糖购自美国Sigma公司。
1.2 方法
1.2.1 角膜上皮及基质细胞培养
 无菌条件下取直径6.0 mm的兔角膜中央部组织,留距角膜缘内外约1 mm的角膜和巩膜组织,于37 ℃、含体积分数5%CO2饱和湿度的条件下,内皮层向下置于六孔板培养;剩余部分消化后去除上皮层、内皮层和后弹力层,将其切成1~2 mm小膜片离心后置于培养基中,37 ℃恒温、体积分数5% CO2环境下孵育,每2 d换液1次。
1.2.2 细胞鉴定 将培养在六孔板中的原代兔角膜上皮及基质细胞部分取出,用BCA试剂测定蛋白浓度。SDS-PAGE方法分离转移,放于10 mL体积分数2%BSA封闭液中,4 ℃封闭过夜;一抗二抗反应后,LabWorksTM 扫描定量。
1.2.3 SF/CS共混膜合成 分别获取100 g·L-1 SF溶液和36.6 g·L-1 CS溶液;将SF和CS按体积比3∶1和4∶1混合,制成混合液;透析冻干,浸入NaOH和甲醇混合溶液中15 min,再用1 mol·L-1 NaOH替换,12~18 h后滤除溶液;中和酸碱度至pH值为7.2~7.4。最后浸泡消毒,用于体外细胞接种和体内植入。
1.2.4 载体膜片的构建 取直径8.5 mm共混膜消毒灭菌,将灭菌后的膜片置于细胞培养池上层,取出角膜基质细胞的培养基,滴于植片表面,平均10个位点,接种密度约为4000个·mm-2;替换培养基,禁忌冲洗,每2 d换液1次,共培养7 d;将大小约2.0 mm×1.0 mm角膜缘组织块置于膜片顶部,并将上皮面向上培育14 d;显微镜下观察细胞培养情况。
1.2.5 CCK-8法检测载体膜片的毒性 96孔板中设调零孔、对照孔和加药孔,调零孔加培养基、CCK-8,对照孔和加药孔均加细胞、培养液、CCK-8,加药孔多加入载体膜。采用单因素方差分析检测各孔的吸光度(A)值,正常培养板为对照组,通过观察加入载体膜后1 d、3 d、5 d、7 d的贴壁细胞数量检测细胞的黏附性。
1.2.6 载体膜片植入动物模型的构建 随机分组法分出正常对照组、SF/CS 3∶1角膜移植组(A组)、SF/CS 4∶1角膜移植组(B组)和羊膜移植组(C组)。术前4 h氯霉素滴眼液滴眼,庆大霉素生理盐水冲洗结膜囊;用30 g·L-1戊巴比妥钠按30 mg·kg-1体质量兔耳缘静脉注射麻醉,倍诺喜滴眼液滴眼2次行眼表面麻醉。6.5 mm环钻于兔角膜中央做标记,取载体膜片5.0 mm置于复方氯化钠溶液中培养待用,在距角膜缘至少4.0 mm角膜印记处用15°尖刀加深切口约1/2角膜厚度,径口宽度约为5.0 mm;虹膜恢复器探入切口钝性分离成直径6.5 mm的口袋式板层角膜切口;将膜片平铺于口袋中,10-0尼龙线缝合1针,线结隐蔽,庆大霉素和地塞米松结膜下注射,术后单笼饲养,典必殊眼膏涂眼,14 d拆除缝线,裂隙灯下观察兔角膜病情变化。
1.2.7 观察排斥反应及判断标准 参照Sonoda等方法[6]。术后14 d内每天裂隙灯下观察,第15天起每2 d一次,评估角膜混浊和新生血管化程度,观察时间为90 d。排除感染、前房出血及其他原因引起的死亡。记录载体膜片完全降解是否出现排斥反应及出现排斥反应的时间和数量,并进行分析。
1.2.8 HE染色组织学检查 在SF/CS 3∶1和4∶1两组中,随机选出带有角膜基质细胞的合成膜各3个。40 g·L-1多聚甲醛固定1 h,沿角膜缘剪取角膜,冲洗、脱水,石蜡包埋,厚5 μm切片,干燥,HE染色后光镜下检查。
1.2.9 移植后角膜切片免疫组织化学染色分析 各组随机选取2只白兔,移植术后2周、1个月、2个月、3个月采取气体栓塞法处死,去除眼球。显微镜下沿角膜缘取角膜,获取厚度为5 μm的切片,每个角膜连续获取20~30张切片,按顺序编号,每眼隔2个序列取切片4张,免疫组织化学染色,倒置显微镜下镜检。
1.3 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件进行分析处理。体外实验各组间比较采用t检验。各组间植片存活时间差异采用One-Way ANOVA分析进行比较。检验水准:α=0.05。
2 结果
2.1 载体膜片物理性质的检测结果 两种膜片的透光率均>60%,说明该载体膜片透光性良好,但与正常的角膜组织间还存在明显差异。两种膜片的吸水性均>90%,明显强于正常角膜(80%)。SF/CS 3∶1的膜片抗张强度为(0.90±0.02)MPa,SF/CS 4∶1膜片为(1.30±0.05)MPa,随膜片中SF增多,抗张强度增强,但均低于正常角膜组织(3.8 MPa)。
2.2 兔上皮细胞、角膜基质细胞和膜材料的共培养
2.2.1 与基质细胞的共培养
 细胞生长良好,没有细胞聚集或脱落的情况,且与膜片间具有良好的相容性,接种48 h后,少量细胞延伸至膜外。HE染色显示,2周后细胞均匀遍布在各层支架网孔间;扫描电镜可见,1周后细胞与载体膜片贴合良好,2周时可成片结合。见图1。



2.2.2 角膜材料与兔角膜基质细胞和上皮细胞共培养 HE染色可见,上皮细胞迁移至载体膜片,呈贴膜生长,且细胞体积大,胞质丰富(图2A)。从组织的纵切面见上皮细胞为3~4层,层间紧密连接,且厚度类似天然兔角膜上皮细胞(图2B)。在红染膜片中可见共培养的兔角膜基质细胞,其细胞蓝染,呈长梭状,普遍较小,结构不清晰,并遍布于各层面。
2.3 载体膜片的毒性检测结果 通过CCK-8试剂盒检测在两种比例SF/CS载体膜上培养了1 d、3 d、5 d、7 d的活角膜基质细胞的A值,结果发现细胞在膜片上的状态良好,能够正常生长繁殖。且各组的细胞活性与时间呈正相关,这与细胞增殖数量有关,各组间的细胞活性检测结果差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。




2.4 体内组织相容性的检测结果
2.4.1 排斥反应的临床观察
2.4.1.1 术后1个月排斥反应临床观察
 术后1个月各组角膜出现不同的表现:A组植片未出现明显的降解,角膜始终保持透明;B组植片可见轻微降解,角膜始终保持透明;C组植片机化明显,有轻度新生血管产生,角膜表现为透明度下降。见图3。



2.4.1.2 术后2个月排斥反应临床观察 术后2个月各组角膜出现较为明显的不一致表现:A组植片出现少量降解,角膜始终保持透明;B组植片可见明显降解,角膜始终保持透明;C组植片机化更加明显,部分出现前房炎症反应,有明显的新生血管产生,角膜表现为透明度进一步下降。见图4。
2.4.1.3 术后3个月排斥反应临床观察 术后3个月各组角膜出现不同的表现:A组植片仍有部分未降解,角膜始终保持透明;B组植片基本全部降解,角膜始终保持透明;C组植片表面白色机化包裹,大量新生血管产生,角膜透明度基本丧失。见图5。




2.4.2 免疫组织化学染色结果 对A组和B组术后各时间点检测CD4+、CD8+、CD31+T细胞,结果均呈阴性;而C组角膜组织内出现新生血管结构,检测CD31+T细胞呈阳性。
2.4.3 载体膜片体内降解度观察 载体膜片存活时间SF/CS 4∶1约为120 d,SF/CS 3∶1约为90 d,SF/CS 4∶1载体膜片存活时间较SF/CS 3∶1膜片长,差异有统计学意义(P<0.05)。
3 讨论
        在过去的研究中,SF/CS混合材料的应用在组织工程学中已有相关报道,如有益于干细胞、HepG2肝细胞和成纤维细胞的培养和生长[7-9],骨组织重建和皮肤再生[10-12]。但目前还未报道过两种成分比例不同对构建的组织工程是否有影响。所以,本实验我们通过制成两种不同比例的SF/CS载体膜片,观察其表面结构、吸水能力、透光程度及抗拉强度,分析组织工程运用这两种材料来构建角膜基质的可行性。结果表明,虽然比例不同,但它们均可形成适当的多孔形态,并且在纵切面上形成相对平行排列的结构,与天然角膜相似,同时还能增大膜的吸水率,但未明显改善膜的力学特性和透光性,特别是抗拉强度,与天然角膜仍存在一定的差距。之前有研究表明,将CS的比例从25%增至75%,极限抗拉能力可增强,但弹性模量随之下降[13]。因此我们推断,材料自身松散的三维结构可能是导致力学特性降低的因素,而三维结构的变化主要取决于CS的含量。
        组织工程生物材料需要具备良好的生物相容性,而材料表面的性质是影响生物相容性的重要因素,其表面性质优良能促进细胞附着,还能促进生物膜迅速再生长。本实验中,我们先将传代的角膜基质细胞均匀种植于多孔的SF/CS载体膜片上,再将原代角膜上皮组织块贴覆在人工材料上,随之分层培养。结果显示,角膜基质细胞能均匀分布在膜片每个层面上,并随时间再生。在接下来的实验中,我们还发现,采取气-液分界面培养法可以达到上皮细胞分层培养并促进其形成复层上皮,从而在体外成功模拟出天然角膜的板层结构。但不同比例成分的膜片对细胞活性的影响不显著,这可能说明基质细胞黏附性与CS的比例没有相关性。以上的研究结果说明,用SF/CS构建的载体膜片能培养出角膜细胞,这一结果体现出良好的细胞生物相容性。同时,我们构建的模型成功模拟出天然板层的生理结构,在体外建立出一个动态的培养模型系统。
        以细胞为基础构建的组织工程角膜,既强调角膜基质细胞能维持高度分化表型,还需有分泌胶原间质的能力。因为维持角膜透明除了排列规律的胶原纤维和均匀分布的蛋白多糖外,细胞的表型还起到关键作用。有研究报道,在涂有CS的材料表面培养球形的角膜基质细胞有助于细胞表型的维持[14]。我们之所以将SF和CS混合,不仅是因为CS可以促进SF形成多孔结构,还因为CS能以一种多糖成分混入其中,进一步来模拟出天然角膜基质的成分,我们希望它能提供一个良好的微环境,以供角膜基质细胞生长。在本研究中,我们发现培养的角膜基质细胞不仅具有良好的黏附性和再生能力,还可以保持细胞活性。与在塑料培养皿中培养的角膜基质细胞相比,在SF/CS载体膜片上培养的细胞有天然的星形细胞结构。
        此外,用于构建组织工程角膜基质的载体,其降解速度必须要能匹配上新生组织生长速度,之前虽然有人研究过基质载体的降解性能,但还没有研究报道合适的载体膜片降解时间。我们结合临床医师经验,认为载体膜片较为合适的降解时间为3个月。我们选择兔子为实验动物,兔角膜基质植入SF/CS载体膜培养,结果显示兔角膜保持透明,无炎症反应,且安全降解吸收时间在3个月左右,SF含量高的膜片组,其降解时间延长,此结果说明角膜基质与载体膜间存在良好的相容性,且SF含量对载体膜降解度有一定的影响,降解时间与SF所占比例呈正相关。另外,使用组织工程化材料替换机体内组织或器官的过程中,经常可出现或轻或重的炎症排斥反应。据报道,与其他合成材料相比,SF/CS显著的优势可能在于降解产物的无毒性,其降解产物较少引起组织渗透压和pH值的局部变化[15]。本实验结果表明,这种载体膜既能够耐受外科手术的强度,还能够在角膜板层口袋中平整地展开。移植术后3个月内该材料几乎没有任何眼内感染的表现,无角膜混浊及新生血管或机化等任何排斥反应,植入载体膜片良好贴合于角膜组织,同时受体角膜细胞良好浸润于膜片中。在膜片降解过程中,我们检测了CD4+T及CD8+T细胞排斥反应标记物,结果均为阴性。这些结果表明,由SF和CS合成载体膜片,不仅拥有良好的生物相容性,同时其降解产物对受体组织不具有毒性,还能促进供体组织的修复和再生,因此作为组织工程角膜基质替代材料有巨大的潜能。
        在本实验中,我们研究并证明了SF/CS载体膜片在未来重建角膜基质方面具备巨大潜力,并更深层次地去探讨两种成分不同构成比例对共混膜物理特性的影响,同时发现CS具有调控支架细胞再生增殖的能力,说明CS还能广泛应用于其他方面,如角膜缺损的修复。但是从应用于临床的可行性来讲,还面临许多问题,这些问题还需要进一步探讨研究,如何兼顾材料的透明性和力学特性、移入的组织是否能够维持细胞的生理功能及浸润在组织工程材料中的基质细胞是否具有分泌细胞外基质的功能等。目前,本研究为选择角膜移植材料提供了一个新方向。