《眼科新进展》  2019年8期 732-736   出版日期：2019-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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PPAR-γ受体激动剂罗格列酮对兔准分子激光角膜切削术后角膜上皮下雾状混浊的影响


        准分子激光角膜切削术（photorefractive keratectomy，PRK）自1983年由Trokel发明至今，经过不断改良，以及围手术期处理的不断改善，以其安全高效、无角膜瓣并发症困扰、可个体化等优势而被广泛应用^［1］。PRK术后，不同程度的角膜下雾状混浊（haze）、术后疼痛、视力恢复时间长等并发症也受到广泛关注。Haze的形成是PRK术后角膜基质细胞纤维化、胶原纤维排列紊乱导致的^［2］，目前临床控制PRK术后haze形成的药物主要有丝裂霉素、类固醇激素等，但可引起激素性高眼压、浅层点状角膜炎、轻度的前房炎症等^［3］。罗格列酮为过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ）激动剂，为噻唑烷二酮类的降糖药，在一些研究中发现，PPARγ配体可以通过转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）/Smad通路改善内脏和皮肤等纤维化程度^［4-6］。本研究通过探讨haze的形成机制，明确PPARγ受体激动剂罗格列酮是否可以改善角膜纤维化的程度，进而抑制PRK术后haze的形成。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物及分组　健康普通级新西兰大白兔64只（济南西岭角养殖繁育中心提供），雌雄不限，体质量2.0~2.5 kg，裂隙灯显微镜排除眼前节疾病，随机分为28 μmol·L^-1罗格列酮组、14 μmol·L^-1罗格列酮组、1 g·L^-1二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）+生理盐水组、单纯PRK组，每组16只（16眼）。本研究遵守滨州医学院动物管理委员会的动物福利伦理要求（编号：20180209-03）。
1.1.2　主要试剂及仪器　DAB显色试剂盒（DA1015）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（D8370，北京索莱宝生物科技有限公司），罗格列酮（R2408，美国Sigma-Aldrich公司），3 g·L^-1氧氟沙星眼膏（沈阳兴齐眼药股份有限公司），4 g·L^-1盐酸奥布卡因滴眼液（日本参天制药株式会社）；小鼠抗兔TGF-β1单克隆抗体（ab190503，1∶50）、小鼠抗兔α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）单克隆抗体（ab7817，1∶100）、小鼠抗兔基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinases-2，MMP-2）单克隆抗体（ab2462，1∶100，英国Abcam公司）；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG H+L（ZB-2305，北京中杉金桥生物技术有限公司）；准分子激光仪VISA STAR S4（美国AMO公司）；裂隙灯显微镜（BQ-900，瑞士Haag-Streit公司）。
1.2　方法
1.2.1　动物模型制作　普通级新西兰大白兔64只（64眼），30 g·L^-1戊巴比妥钠经耳缘静脉推注行全身麻醉，4 g·L^-1盐酸奥布卡因滴眼液滴眼行表面麻醉成功后行右眼PRK手术，激光参数：采用准分子激光治疗性角膜切削术（phototherapeutic keratectomy，PTK）去除上皮，角膜中央区切削直径6.0 mm，切削厚度100 μm。术后平衡盐溶液（复方氯化钠注射液，山东齐都药业有限公司）冲洗角膜，吸水海绵吸干角膜表面水分，绷带式角膜接触镜（Pure Vision，美国Bausch & Lomb公司）覆盖右眼，3 g·L^-1氧氟沙星眼膏滴眼，每天3次，每次1滴。各组分别给予28 μmol·L^-1罗格列酮、14 μmol·L^-1罗格列酮、1 g·L^-1DMSO+生理盐水滴眼，每天3次，每次1滴；单纯PRK组未行任何特殊处理。PRK术后 7 d、28 d，各组分别处死8只（8眼）兔，取角膜固定、包埋制作4 μm石蜡切片。
1.2.2　罗格列酮滴眼液的配制　DMSO助溶罗格列酮，配制为28 mmol·L^-1原液，在无菌操作下分别用生理盐水稀释为14 μmol·L^-1罗格列酮滴眼液、28 μmol·L^-1罗格列酮滴眼液，DMSO含量1 g·L^-1，4 ℃ 分装保存于高压灭菌后的2 mL离心管（MCT-200-C，美国Axygen生物技术有限公司）中，PRK术后采用2 mL一次性无菌巴氏吸管（318112，无锡耐思生物科技有限公司）给药，每天3次，每次1滴。
1.2.3　术后眼前节观察及处理　PRK术后每天用裂隙灯显微镜观察角膜上皮愈合情况并用前节照相记录术后7 d、28 d haze情况，行 Fantes 分级：0级：角膜完全透明；0.5级：裂隙灯斜照法可见轻度角膜混浊；1级：裂隙灯直照法可见轻度角膜混浊，不影响观察虹膜纹理；2级：裂隙灯直接聚焦可见角膜轻度混浊，影响观察虹膜纹理；3级：角膜中度混浊，明显影响观察虹膜纹理；4级：角膜重度混浊，无法透见虹膜纹理^［7］。
1.2.4　免疫组织化学法检测角膜TGF-β1、α-SMA及MMP-2的表达　取PRK术后7 d、28 d的角膜石蜡切片，经脱蜡、复水，高压修复抗原、封闭后，分别滴加小鼠抗兔一抗TGF-β1、α-SMA及MMP-2孵育，冲洗后滴加辣根酶标记山羊抗小鼠二抗孵育，行DAB显色，角膜中出现棕黄色着染即为阳性。苏木素染色、脱水、透明后封片，于光学显微镜下观察角膜组织阳性表达，每张切片选择3个视野，通过IPP图像分析系统采集图像并测量平均吸光度（A）值。
1.3　统计学方法　采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。所有数据经Shapiro-Wilk检验呈正态分布，经Levene检验符合方差齐性，均采用均数±标准差表示。各组PRK术后角膜上皮完全愈合时间行方差分析F检验；PRK术后7 d、28 d的haze分级和TGF-β1、α-SMA、MMP-2的平均A值应用单因素方差分析，组间多重比较行LSD-t检验。检验水准：α=0.05。
2　结果
2.1　角膜上皮愈合时间　PRK术后每天采用裂隙灯观察兔眼，各组角膜上皮于3~4 d愈合，角膜上皮愈合时间比较，组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。
2.2　Haze分级　PRK术后7 d、28 d，各组角膜均出现不同程度haze，其中28 μmol·L^-1罗格列酮组haze最轻；14 μmol·L^-1罗格列酮组次之，明显轻于1 g·L^-1 DMSO+生理盐水组与单纯PRK组。PRK术后7 d、28 d时，各组角膜haze分级组间差异均有统计学意义（均为P＜0.05），除1 g·L^-1 DMSO+生理盐水组与单纯PRK组间差异均无统计学意义（均为P＞0.05）外，其余组间两两比较差异均有统计学意义（均为P＜0.05），见表1、图1。
2.3　免疫组织化学法检测角膜中TGF-β1、α-SMA、MMP-2表达　PRK术后7 d，各组均出现TGF-β1、α-SMA、MMP-2表达（图2-图4），在1 g·L^-1DMSO+生理盐水组及单纯PRK组中呈中等阳性，其次为14 μmol·L^-1罗格列酮组，28 μmol·L^-1罗格列酮组最轻，呈弱阳性；PRK术后28 d，各实验组TGF-β1、α-SMA、MMP-2表达增强。PRK术后7 d、28 d时，TGF-β1、α-SMA、MMP-2表达组间差异均有统计学意义（均为P＜0.05），其中除1 g·L^-1DMSO+生理盐水组与单纯PRK组间差异均无统计学意义（均为 P＞0.05）外，其余组间两两比较差异均有统计学意义（均为P＜0.05），见表1。







3　讨论
        PRK术后haze的形成主要是由TGF-β1介导的角膜基质细胞纤维化的过程，是角膜创伤愈合及细胞凋亡的结果。haze导致了PRK术后角膜透明性的下降以及屈光回退的发生。PRK术后角膜细胞凋亡，角膜基质细胞在TGF-β1等细胞因子的作用下转化为角膜成纤维细胞，分化为角膜肌成纤维细胞，TGF-β1为这一过程的关键调控因子^［8-10］。肌成纤维细胞特征性地表达α-SMA^［11］，并促进细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的大量合成。MMP-2作为ECM重建所必需的细胞因子，由成纤维细胞产生，为Ⅳ型胶原酶，可降解基质主要骨架蛋白，并促使胶原纤维排列紊乱^［12］，ECM也可反向促进肌成纤维细胞增生，胶原的新生与降解失去平衡，胶原纤维排列紊乱，从而形成haze。本研究结果显示，PRK术后7 d，各组均产生不同程度的haze，TGF-β1、α-SMA、MMP-2在角膜中表达；PRK术后28 d，haze较前加重，同时角膜中TGF-β1、α-SMA、MMP-2的表达增加，与haze的严重程度相一致。由此证明，在haze的发生发展过程中，TGF-β1、α-SMA、MMP-2等细胞因子发挥了重要作用。
        PPARs是一种转录因子，属于配体活化型核受体超家族成员，通过被配体激活，进而调节细胞功能，可分为PPARα、PPARβ和PPARγ三种亚型。在近几年的研究中显示，激活PPARγ可以有效抑制眼部组织纤维化，进而用于眼结膜、角膜瘢痕化的治疗^［13-14］，罗格列酮为PPAR-γ的合成型配体，可以激活PPAR-γ发挥作用。有研究显示，应用PPAR-γ激动剂罗格列酮干预人眼Tenon囊成纤维细胞后，可以抑制TGF-β1的表达^［15］。Huxlin等^［16］在对角膜抗瘢痕药物的研究中证实，局部应用罗格列酮可以减轻猫角膜的瘢痕形成，抑制TGF-β1和α-SMA的表达；本研究发现，PRK术后给予罗格列酮滴眼，角膜haze较1 g·L^-1 DMSO+生理盐水组及单纯PRK组明显减轻，TGF-β1、α-SMA、MMP-2的表达均受到抑制，这与Huxlin等^［16］研究结果相一致。另外，有研究显示，不同浓度罗格列酮对人眼Tenon囊成纤维细胞TGF-β1的抑制作用存在差异，高浓度抑制作用强于低浓度^［15］，本研究结果同样证实了这一观点，我们发现在PRK术后不同时间点，28 μmol·L^-1罗格列酮组角膜中TGF-β1的表达低于14 μmol·L^-1罗格列酮组，提示罗格列酮对PRK术后haze的抑制作用存在浓度依赖性。
        综上所述，PRK术后haze的形成是多种细胞因子共同参与的复杂过程，TGF-β1介导的角膜肌成纤维细胞增生紊乱是haze的始发因素之一，α-SMA、MMP-2等因子相继促进了haze的发展，TGF-β1介导角膜基质细胞纤维化的过程主要通过细胞内Smad信号通路介导^［17］，Smad蛋白作为TGF-β1受体的细胞内激酶底物，介导TGF-β1细胞内信号转导，分为激活型、辅助型以及抑制型Smad，其中Smad 2、Smad 3为激活型蛋白，Smad 7为抑制型蛋白^［18］。兔PRK术后应用PPAR-γ受体激动剂罗格列酮可以有效抑制角膜TGF-β1、α-SMA、MMP-2的表达，减少haze的形成，并且呈浓度依赖性。其机制可能与竞争性抑制TGF-β1/Smad通路介导促纤维化作用有关，其他动物器官纤维化的研究提示，TGF-β1/Smad发挥细胞效应需要募集辅活化因子P300，与Smad 2、Smad 3及靶基因结合从而调节转录，发生纤维化过程；PPARγ在胞内通过与配体结合激活时，也需要与P300结合，引起靶基因转录，而TGF-β1/Smad通路与PPAR-γ通路共用的辅活化因子P300在细胞内数量有限，因此存在竞争-抑制现象^［19-24］。但是，PPAR-γ与TGF-β1/Smad通路间的具体作用机制尚未完全清楚，罗格列酮给药浓度界限也需要通过进一步的实验进行明确，我们会在接下来的实验中进一步研究。