《眼科新进展》  2019年8期 728-731   出版日期：2019-08-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

---

不同剂量N-乙酰-5-羟色胺（NAS）对视网膜缺血-再灌注损伤大鼠视网膜细胞凋亡的影响


        视网膜缺血-再灌注损伤（retinal ischemia-reperfusion injury，RIRI）常见于青光眼、视网膜血管闭塞和糖尿病视网膜病变等眼部疾病^［1］，是目前造成视力障碍和失明的主要原因。因此，寻找RIRI行之有效的治疗方案成为眼科研究的焦点。N-乙酰-5-羟色胺（N-acetylserotonin，NAS）是褪黑素的前体物质^［2-3］，具有抗氧化、抗凋亡等生物学功能。我们课题组前期研究发现，NAS可减轻RIRI大鼠视网膜细胞凋亡，具有神经保护作用^［4-5］，但不同剂量的NAS治疗对RIRI大鼠视网膜细胞损伤的影响尚未见报道，选择适宜剂量的NAS对于治疗RIRI具有重要意义。本研究采用HE染色、免疫组织化学和TUNEL法来观察腹腔注射不同剂量的NAS对RIRI大鼠视网膜组织病理学、活性Caspase-3蛋白表达以及细胞凋亡的影响，以期为NAS较优剂量的选择及其临床应用提供一定的理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物及分组　健康成年雄性SD大鼠42只，体质量220～250 g（济南朋悦实验动物繁育有限公司）。采用随机数字表法将大鼠分为正常对照组（6只）、RIRI 组（18只）和NAS组（18只）；NAS组按照给药剂量的不同分为NAS低剂量组（5 mg·kg^-1）、NAS中剂量组（10 mg·kg^-1）和NAS高剂量组（20 mg·kg^-1）。NAS组于造模前后 30 min腹腔给药，RIRI 组腹腔注射相应等体积的生理盐水。
1.1.2　主要试剂与仪器　NAS（美国，Sigma公司）；兔抗活性 Caspase-3（美国，Cell Signaling Technology公司）；兔抗二步法试剂盒（PV-9001）、二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒（ZLI-9018）（北京中杉金桥生物技术有限公司）；HE 染色试剂盒（碧云天生物技术有限公司）；TUNEL试剂盒（德国，Roche公司）。石蜡切片机（Shandon Finesse325，美国Thermo公司）、研究级正置光学显微镜（BX-51，日本Olympus公司），电子分析天平（AL-204，美国Mettler Toledo公司）。
1.2　方法
1.2.1　RIRI动物模型制作　采用前房高眼压法建立大鼠RIRI模型^［6］。100 g·L^-1水合氯醛（3.5 mL·kg^-1）腹腔注射麻醉，5.5号针头自大鼠右眼颞侧角膜缘刺入前房（确保角膜内皮、虹膜和晶状体无损伤），升高盐水瓶，使眼压增加至110 mmHg（1 kPa=7.5 mmHg），可见眼底苍白，角膜雾浊，前房变深。直接检眼镜观察发现大鼠视网膜血流中断，RIRI造模成功。持续 60 min，拔出针头，视网膜血供恢复，可乐必妥眼液滴眼预防感染。
1.2.2　标本采集及石蜡切片的制作　各组大鼠于RIRI后24 h，取右侧眼球用40 g·L^-1多聚甲醛固定，去除晶状体后梯度乙醇脱水，二甲苯透明，浸蜡后行石蜡包埋，平行于眼球矢状位行非连续切片，每4～5张切片取1张，厚度为4 μm。
1.2.3　HE染色　石蜡切片脱蜡至水，苏木素染液染核，双蒸水终止染色，分化液分化，脱洗，伊红染色30 s，体积分数95%乙醇脱色，体积分数100%乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察各组大鼠视网膜细胞形态学的变化，应用Cellsens1.6图像分析软件测量视盘外200~300 μm距离内任意四点的内界膜至外丛状层内缘的距离，取平均值，并计数该100 μm长度内单位面积视网膜神经节细胞（retinal ganglion cell，RGC）数量。
1.2.4　免疫组织化学检测活性Caspase-3蛋白表达　石蜡切片脱蜡至水，98 ℃水浴抗原修复，体积分数3％H₂O₂去离子水去除内源性过氧化物酶。正常山羊血清消除背景非特异着色，加入兔抗活性Caspase-3（1∶100），4 ℃冰箱过夜；37 ℃恒温箱复温后用0.01 mol·L^-1 PBS冲洗，滴加抗兔二抗试剂盒试剂，PBS 冲洗，DAB 显色，苏木素染核，体积分数1%盐酸乙醇分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。于光学显微镜下观察，计数RGC层和内核层活性Caspase-3阳性细胞数。
1.2.5　TUNEL染色法检测视网膜凋亡细胞　石蜡切片脱蜡至水，蛋白酶K工作液37 ℃孵育30 min，加TUNEL反应混合液暗盒中37 ℃孵育60 min，转化型-POD 信号转化30 min，DAB显色剂与底物反应显色，苏木素染核，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下计数神经节细胞层和内核层凋亡细胞数并拍照。
1.3　统计学处理　采用SPSS 18.0统计学软件对数据进行统计学分析，所有计量资料采用x?±s表示，组间差异采用单因素方差分析，方差齐性时，组间两两比较采用SNK-q法进行统计学分析，检验水准：α=0.05。
2　结果
2.1　HE染色结果　HE染色结果显示，正常对照组大鼠视网膜各层结构规整，细胞排列整齐，RGC形态规则，分布均匀（图1A）。RIRI组视网膜内层厚度［（60.54±2.52）μm］和NAS低、中、高剂量组视网膜内层厚度［（56.78±1.78）μm、（53.24±1.68） μm、（52.71±1.52） μm］均较正常对照组［（49.82±1.50）μm］增厚（F=126.992、84.001、22.755、18.293，均为P<0.01）。RIRI组RGC数［（719.89±83.67）个·mm^-2］和NAS低、中、高剂量组［（882.09±55.62）个·mm^-2、（1113.65±74.40）个·mm^-2、（1132.20±96.15）个·mm^-2］均较正常对照组［（1489.17±113.50）个·mm^-2］明显减少（F=277.143、190.464、70.870、50.140，均为 P<0.01）。NAS各剂量组大鼠视网膜细胞较RIRI 组排列整齐，内层水肿减轻，厚度变薄（F=12.315、52.407、63.694，均为P<0.01），RGC数增加（F=21.521、111.310、89.496，均为P<0.01）。NAS中、高剂量组较NAS低剂量组视网膜内层厚度变薄（F=17.825、25.808，均为P<0.01），RGC数显著增多（F=51.660、40.584，均为P<0.01）；而NAS中剂量组和NAS高剂量组比较，内层视网膜厚度和RGC数变化不大（F=0.482、0.202，均为P>0.05）。见图1。
2.2　各组视网膜中活性Caspase-3阳性细胞表达比较　正常对照组可见极少量的活性Caspase-3阳性细胞，为（95.37±10.93）个·mm^-2；RIRI组为（246.08±19.23）个·mm^-2，NAS中剂量组［（142.77±18.25）个·mm^-2］和NAS高剂量组［（133.10±15.19）个·mm^-2］较低剂量组［（196.95±19.83）个·mm^-2］活性Caspase-3阳性细胞数均有减少（F=70.154、93.722，均为P<0.01）；NAS中剂量组与NAS高剂量组比较，活性Caspase-3阳性细胞数差异无统计学意义（F=2.644，P>0.05）。RIRI组和NAS各剂量组活性Caspase-3阳性细胞数均多于正常对照组（F=400.048、178.283、46.592、37.777，均为P<0.01）。NAS各剂量组活性Caspase-3阳性细胞数均显著少于RIRI组，差异有统计学意义（F=42.016、119.816、280.008，均为P<0.01）。见图2。




2.3　各组视网膜中凋亡细胞数的比较　正常对照组视网膜偶见少量凋亡细胞，TUNEL阳性细胞数为（81.98±11.29）个·mm^-2；NAS低剂量组［（175.06±17.69）个·mm^-2］、中剂量组［（108.85±13.41）个·mm^-2］和高剂量组［（100.37±13.53）个·mm^-2］TUNEL阳性细胞数均较RIRI组［（225.45±18.93）个·mm^-2］减少，差异均有统计学意义（F=38.148、274.132、250.125，均为P<0.01）。NAS中、高剂量组TUNEL阳性细胞数均较NAS低剂量组减少明显（F=115.660、113.680，均为P<0.01）；NAS中、高剂量组TUNEL阳性细胞数差异无统计学意义（F=2.112，P>0.05）。RIRI组和NAS各剂量组TUNEL阳性细胞数均多于较正常对照组（F=454.790、241.139、29.109、11.525，均为P<0.01）。见图3。



3　讨论
        RIRI常见于眼科多种疾病，早期由于活性氧的大量产生可诱导多种炎症介质以及视网膜细胞凋亡。RIRI早期，RGC层、内丛状层和内核层明显水肿、增厚，RGC数减少。本研究发现，RIRI后24 h，RIRI组大鼠视网膜内层厚度较正常对照组明显增加，且RGC数较正常对照组减少，这均与文献报道一致^［7］，同时，也证明本研究中RIRI模型造模成功。鉴于NAS具有抗凋亡等神经保护作用^［8-9］，本研究探讨不同剂量NAS对RIRI大鼠视网膜损伤的影响，对其临床应用也具有重要意义。本研究发现，RIRI大鼠给予NAS治疗后，NAS各剂量组大鼠视网膜厚度均较 RIRI 组变薄，RGC数均较RIRI组增加，推测NAS治疗可减轻RIRI大鼠视网膜细胞水肿并保护视网膜细胞，从而减轻大鼠RIRI。RIRI后24 h，NAS中、高剂量组疗效均优于NAS低剂量组，且NAS中、高剂量组之间视网膜厚度及RGC数变化不明显，提示中剂量NAS治疗是较优方案。不同剂量NAS治疗对RIRI大鼠远期视网膜组织形态学及RGC数的影响及其相关机制有待进一步研究。
        RIRI可导致视网膜细胞凋亡，半胱氨酸蛋白酶家族（Caspases）活化介导的蛋白酶级联反应是细胞凋亡经典途径，其中活性Caspase-3作为Caspases 的主要效应物，是细胞凋亡的关键执行蛋白^［10-11］。RIRI后，视网膜细胞在凋亡信号级联反应的作用下，Asp175 残基上的非活性Caspase-3发生裂解，产生有活性的Caspase-3蛋白。原位末端标记检测（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）是检测细胞凋亡常用的方法，广泛应用于基础研究中凋亡细胞的检测^［12］。Champlin等^［13］研究发现，RIRI后6 h，RGC层及内核层凋亡细胞数较正常对照组显著升高，24 h达到较高水平，之后凋亡细胞数下降。本研究采用免疫组织化学法和TUNEL法观察不同剂量NAS治疗对RIRI大鼠视网膜细胞凋亡的影响，进一步探讨NAS治疗大鼠RIRI优选的机制，结果发现，RIRI后24 h，RIRI 组大鼠视网膜RGC层及内核层出现大量的活性Caspase-3阳性和TUNEL阳性细胞，且显著多于正常对照组，进一步证明RIRI大鼠模型制作成功；NAS各剂量组视网膜活性 Caspase-3阳性、TUNEL阳性细胞数均显著少于RIRI组，提示NAS可减轻细胞凋亡，具有神经保护作用。NAS不同剂量组间比较，发现NAS低剂量组活性Caspase-3阳性细胞、TUNEL阳性细胞数均多于NAS中、高剂量组，而NAS中剂量组和NAS高剂量组之间活性Caspase-3阳性细胞、TUNEL阳性细胞数差别变化不显著，提示中、高剂量NAS治疗方案抗凋亡疗效佳，中剂量NAS治疗达到较好的疗效，是RIRI大鼠治疗的优选。
        综上所述，不同剂量NAS治疗均可抑制RIRI大鼠视网膜细胞中活性Caspase-3蛋白的表达及视网膜细胞凋亡，中剂量NAS治疗方案较优，抑制细胞凋亡效果较佳，可减轻RIRI，具有神经保护作用，为NAS临床治疗RIRI提供了一定的理论依据。