《眼科新进展》  2019年4期 316-320   出版日期：2019-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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NF-κB抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯（PDTC）对角膜移植大鼠角膜组织的影响


        许多种角膜疾病都可能导致视力完全丧失，目前角膜移植是治疗不可逆性角膜盲的最重要手段^［1］。它不仅能够提高视力，还有助于控制急性感染性炎症，保持眼球的完整性。角膜移植术虽是目前最成功的器官移植手术，但移植排斥反应仍是移植失败的首要原因^［2］。尽管常规应用免疫抑制剂，但仍有近一半的排斥反应不可逆转。核转录因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是参与基因转录的蛋白质分子，文献报道其是参与免疫反应、炎症反应以及细胞凋亡等多种反应的调控者，在器官移植排斥反应中起着中心调控者的作用^［3-4］。本文探讨NF-κB抑制剂吡咯二硫氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）对角膜移植大鼠角膜组织的影响。
1　材料与方法
1.1　实验动物　取健康清洁级SD（Sprague Dawley）大鼠及Wistar大鼠，雌雄兼用，体质量200~250 g，鼠龄2~3个月。SD大鼠28只，由西安交通大学医学院医学实验动物中心提供。Wistar大鼠14只，由郑州大学医学院实验动物中心提供。将大鼠均置于标准环境（室温25 ℃±1 ℃，湿度60%±10%），12 h明暗交替周期（早上8∶00到晚上8∶00）饲养。实验动物使用及实验条件符合国家科学技术委员会制定的《实验动物管理条例》。
1.2　实验材料
1.2.1　PDTC滴眼液的配制　PDTC浓度参考Yoshida等^［5］应用于玻璃体内的浓度，文献中认为1 mg·mL^-1PDTC是抑制视网膜新生血管的最低有效浓度，且该浓度对眼无毒副作用。取200 mg PDTC溶于200 mL双蒸水中配制成PDTC滴眼液，调pH值为6.8~7.2，微孔滤膜过滤除菌。避光置于4 ℃冰箱备用。
1.2.2　主要仪器与试剂　裂隙灯前节照相系统（苏州六六视觉科技股份有限公司），光学显微镜（日本 Olympus BX41），石蜡切片机（德国 Leica RM2235），眼科手术显微镜（日本 TOPCON），无损伤缝合线10-0（美国 Alcon公司），NF-κB p65单克隆抗体血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）单克隆抗体（美国 SANTA CRUZ，小鼠抗大鼠），小鼠抗大鼠CD4 FITC、小鼠抗大鼠CD8 FITC、小鼠IgG1阴性对照FITC（英国 Serotec），SABC免疫组织化学试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），100 g·L^-1水合氯醛溶液（西安交通大学医学院第一附属医院药剂科），PDTC（美国Sigma Aldrich公司）。
1.3　实验方法
1.3.1　大鼠同种异体角膜移植模型的建立　参照Williams等^［6］方法建立模型。供体鼠提供双眼角膜，受体鼠均以左眼为术眼。术前散瞳充分后，水合氯醛溶液4 mL·kg^-1腹腔注射，倍诺喜滴眼液表面麻醉，常规无菌操作，手术全程在显微镜下进行。供体角膜植片制作：用3.25 mm直径环钻在供体鼠角膜中央钻切，直到某象限穿通，取下角膜植片，置于黏弹剂Healon中备用。植床制备：作上下睑牵引线，直径3.0 mm环钻钻取中央区角膜，将植片置于植床，以10-0尼龙丝线间断缝合8针，线结暴露不包埋。术毕涂红霉素眼膏，缝合睑缘。大鼠同种异体角膜移植术后，其中有麻醉意外等原因发生，按排除标准剔除出组，并及时补充相等数量的实验动物模型，观察期内无受体鼠死亡，实验动物模型总数恒定。按照排斥反应评分标准^［6］确定角膜植片的存活时间。
1.3.2　动物分组　14只Wistar大鼠均为供体鼠，提供双眼角膜；28只SD大鼠为受体鼠，均以左眼为术眼，右眼设为正常对照。手术完成后将28只SD大鼠随机分为3组，对照组（10只）以生理盐水滴左眼，实验组（10只）以1 mg·mL^-1 PDTC滴左眼，均为每天3次，每次1滴，空白组（8只）不做任何处理。以上治疗均从术后第1天开始，至取标本或实验观察期结束为止。
1.3.3　角膜新生血管评分　术后第1天起，分别在术后第5天、第15天、第25天在裂隙灯下观察各组大鼠角膜新生血管的情况并以混浊、水肿及新生血管三项指标进行评分。观察期终点设定为术后25 d。每次测定并记录从角巩膜缘长出的新生血管长度，由2人同时观察并记录、测量，参照Holland等^［7］文献进行评分。
1.3.4　各组角膜病理学及免疫组织化学染色观察　处死受体大鼠，摘取大鼠左眼球，将各组大鼠左眼球分别固定于40 g·L^-1多聚甲醛溶液内^［8-9］，梯度酒精脱水，浸蜡，石蜡包埋，常规石蜡切片，片厚4 μm，取每一个角膜标本的部分切片进行HE染色后在光学显微镜下观察组织病理学改变；剩余部分切片分别进行NF-κB及细胞因子VEGF免疫组织化学染色。采用SABC法，依说明书步骤进行，在光学显微镜下观察结果。
1.4　统计学分析　使用统计学软件SPSS 17.0处理数据，免疫组织化学结果数据采用单因素方差分析，以均数±标准差表示；角膜植片存活时间，采用单因素方差分析，并建立Kaplan-Meier生存曲线，采用Log Rank法检验对比组间的差异，α=0.05。
2　结果
2.1　各组角膜移植排斥反应发生的时间　对照组、实验组、空白组角膜移植排斥反应发生的时间分别为（10.80±1.40）d、（23.40±2.30）d、（11.20±2.06）d，实验组排斥反应发生的时间较对照组明显延长，差异有统计学意义（P<0.01）。
2.2　术后不同时间各组角膜植片新生血管数、新生血管面积、排斥反应指数　对照组新生血管一般术后第3~5天出现，并很快进入植片周边，沿缝线处向角膜植片中央粗大生长。实验组新生血管一般术后第5~7天出现，生长速度较慢，血管稀疏。术后不同时间实验组新生血管数、新生血管面积及排斥反应指数均小于对照组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见表1。



2.3　各组大鼠术后角膜组织病理学观察结果　正常大鼠角膜上皮由5~6层细胞构成，上皮结构完整，细胞排列大致正常；角膜基质层胶原排列整齐（图1A）。角膜移植术后，实验组大鼠角膜上皮基底细胞内出现较多空泡，角膜基质层内出现间质水肿（图1B）；炎症细胞浸润，并见新生的毛细血管（图1C）；缝线及切口周围见大量淋巴细胞浸润，部分植片中央发生散在的炎症细胞浸润、角膜上皮部分脱落（图1D）。对照组角膜植片水肿及炎症细胞的浸润程度较实验组明显增加，且对照组角膜植片显著增厚，基质结构疏松、紊乱；实验组角膜植片相对基质板层结构排列有序，新生血管数在相同时间内明显减少。
2.4　NF-κB及VEGF在角膜植片的表达
2.4.1　NF-κB在角膜植片的表达情况　免疫组织化学染色显示，NF-κB阳性细胞为细胞核呈棕黄色或棕黑色的细胞。对照组（图2A）、实验组（图2B）角膜上皮细胞、基质层细胞及新生血管内皮细胞内均有NF-κB阳性表达。NF-κB阳性细胞数，实验组



为每400倍视野（4.236±0.856）个，较对照组［（18.451±1.234）个］明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。空白组大鼠角膜内鲜有阳性表达（图2C）。



2.4.2　VEGF在角膜植片的表达情况　免疫组织化学染色显示，细胞膜、细胞浆呈棕黄色或棕黑色者为VEGF阳性细胞。VEGF在对照组（图3A）、实验组（图3B）大鼠角膜植片的上皮层及基质层均有表达，新生血管内皮细胞内亦有阳性表达；VEGF阳性细胞数，实验组为每400倍视野（2.631±0.238）个，较对照组［（6.254±0.721）个］明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。空白组大鼠角膜内鲜有阳性表达（图3C）。



3　讨论
        同种异体之间进行角膜移植是治疗角膜疾病致盲最为有效的方法，研究表明^［10］角膜移植排斥反应是一个由T淋巴细胞介导并参与的复杂过程，受很多因素调节。近年来越来越多的研究试图阐明以NF-κB为核心的基因调控网络在器官移植排斥反应中的作用^［11］。
        目前，排斥反应仍是角膜移植失败的主要原因，动物模型可以更好地帮助人们了解角膜移植排斥反应的病理过程。研究人员制作了多种动物角膜移植模型^{［10，12-13］}。早期多采用兔子、羊等较大的动物以求手术上的成功率，但由于其供体和受体组织相容性差异难以控制，且缺乏常用的相应免疫试剂，逐渐趋于淘汰。由于大鼠角膜MHC抗原的表达与人类角膜相似且移植手术难度小于小鼠，所以大鼠角膜移植模型仍为许多研究者首选。本实验从模型建立的可行性及动模模型的特点出发，采用远交群SD和Wistar大鼠建立同种异体角膜移植模型，利用保留缝线等来保证异体移植排斥反应的发生，提高动物模型的成功率。移植后各组大鼠角膜植片混浊、水肿及新生血管发生及发展规律一致，在实验观察终点时除一只尚未发生排斥外（术后27 d发生排斥），各移植组均在相对应的植片存活时间范围内发生排斥反应。动物模型的成功建立为本实验后续的实施奠定了稳定且可信的研究基础。
        移植术后角膜新生血管是角膜移植发生排斥反应的主要危险因素^［14］。目前研究表明，角膜新生血管的出现是一个复杂的病理过程，受多种因素的调节，并且有许多细胞因子、黏附分子参与了角膜新生血管形成^［15］。生理情况下，新生血管生长有一套严密的调节体系加以控制，抗血管生成因子（血管抑素^［16］ 、内皮抑素^［17］等）和血管生成因子（VEGF^［18］、成纤维细胞生长因子等）处于一种平衡状态。当这种平衡被破坏时，即可导致新生血管出现。研究表明^［18-19］，VEGF是眼部新生血管生成过程中最关键、最重要的细胞因子。NF-κB在转录水平调控着多种血管生成因子的表达如VEGF，并且VEGF可在上游以NF-κB为靶点起到调控作用^［20-22］，但尚未见靶向抑制NF-κB与角膜移植术后角膜新生血管的相关研究。所以本实验应用PDTC特异性抑制NF-κB活性而调节其下游某些在新生血管形成中起重要作用的因子，以期达到抑制大鼠术后新生血管生成的作用。本研究也证实了通过抑制NF-κB活性可以下调VEGF的表达，抑制同种异体角膜移植术后角膜新生血管的发生，NF-κB及其下游调控的VEGF在角膜新生血管的形成过程中发挥着较为关键的作用。
        有研究表明^［23］，活化的NF-κB介导其他多种促血管生成因子表达，如IL-8、ICAM-1、VCAM-1等，上述促血管生成因子又影响上调VEGF基因的表达。VEGF反过来又能增强NF-κB结合能力，形成一正反馈环路，共同促进新生血管的形成。此外，NF-κB对于新生血管形成的调节作用，还表现为NF-κB可以促进MMP2、MMP9的表达^［24］，从而加速血管下基底膜的降解及角膜新生血管的形成。Joyce等^［25］证实，NF-κB还能增强细胞周期蛋白D的表达，促进血管内皮细胞和平滑肌细胞的增殖。因此，活化的NF-κB通过直接与间接的多种途径，有效地促进新生血管的生成^［26］，可能对新生血管形成具有核心的调节作用。对该靶点的阻断可能较单一阻断新生血管形成中某一作用因子（如单一拮抗VEGF或VEGF受体，负向调控VEGF或其受体表达）更为有效地抑制新生血管的生成。