《眼科新进展》  2019年4期 306-311   出版日期:2019-04-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
青蒿素对过氧化氢诱导的人视网膜色素上皮(RPE)细胞氧化应激损伤的抑制作用


        老年性黄斑变性(senile macular degeneration,SMD)又称年龄相关性黄斑变性,是老年人群永久性致盲的首要原因,其发病率随年龄增长显著升高,欧美发达国家发病率较高[1]。随着我国人口老龄化,SMD的发病率呈现逐年上升趋势。根据临床表现和病理分型可将SMD分成两类:干性(萎缩性)SMD和湿性(渗出性)SMD。SMD患者视力丧失的主要原因包括新生血管形成、黄斑区出现地图样萎缩以及视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)层和光感受器功能退化[2]。研究表明,氧化应激损伤致使大量活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)在视网膜堆积,RPE层吞噬功能障碍最终可成为SMD发生的重要原因之一[3]。青蒿素(Artemisinin)是从中药菊科植物黄花蒿提取的倍半萜内酯药物,近年来研究发现,青蒿素不仅在抗疟疾方面有良好疗效,在抗肿瘤、抗炎以及抗氧化应激中也具有不可忽视的作用[4]。本研究利用过氧化氢诱导氧化应激损伤RPE细胞模型,探讨青蒿素对过氧化氢诱导的RPE细胞氧化应激损伤的抑制作用。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器 青蒿素(美国Selleck公司),人RPE细胞株ARPE-19(美国ATCC公司),体积分数3%过氧化氢(美国Sigma公司),F12-MEM培养基(美国Hyclone公司),胎牛血清(美国GEMINI公司),Hoechst33342试剂盒、ROS检测试剂盒、JC-1检测试剂盒(上海碧云天公司),超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase,SOD)试剂盒 (南京建成生物工程研究所有限公司),PARP单克隆抗体、Nrf2单克隆抗体、Keap1单克隆抗体、HO-1单克隆抗体、cleave-Caspase3单克隆抗体(美国CST公司),Bcl-2单克隆抗体(英国Abcam公司),共聚焦显微镜(日本OLYMPUS公司),酶标仪(美国BIOTEK公司),分子成像系统(美国GE公司)。
1.2 方法
1.2.1 MTT法筛选青蒿素最佳药物浓度 将细胞接种于96孔板,每孔7×103个细胞,细胞贴壁后分别加入0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1、40 μmol·L-1、50 μmol·L-1青蒿素,筛选对细胞增殖有效的最佳药物浓度,作用时间为24 h。24 h后弃培养液,每孔加入含有20 μL浓度为5 g·L-1的MTT无血清培养液,37 ℃培养4 h后弃培养液,每孔加入150 μL DMSO溶液,置摇床使甲臜完全溶解后用酶标仪在490 nm波长下测定吸光度值,根据吸光度值计算细胞增殖率。
1.2.2 细胞分组 根据前期对过氧化氢作用细胞半数致死量浓度筛选,选择浓度为100 μmol·L-1作为过氧化氢造模加药浓度;根据MTT实验结果选择30 μmol·L-1作为青蒿素最佳浓度,将APRE-19细胞分成4组。对照组:不做特殊处理;过氧化氢组:加入100 μmol·L-1过氧化氢作用细胞24 h;青蒿素组:加入青蒿素30 μmol·L-1,作用细胞24 h;青蒿素预保护组:加入30 μmol·L-1青蒿素预保护细胞24 h后加入100 μmol·L-1 过氧化氢作用24 h。
1.2.3 Hoechst33342染色 将细胞接种于6孔板内,每孔10×103个细胞,细胞贴壁处理后,弃完全培养基,磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline,PBS)洗涤2次后加入Hoechst33342,避光孵育15 min后PBS洗涤3次,用荧光显微镜观察细胞凋亡形态及荧光强度。
1.2.4 线粒体膜电位检测 将细胞接种于共聚焦培养皿中,每皿8×103个细胞,待细胞贴壁后加药处理,弃培养液,用PBS洗涤后加入1 mL JC-1染色工作液充分混匀,置37 ℃细胞培养箱孵育20 min。孵育结束后吸出上清用JC-1染色缓冲液洗涤2次,加入1 mL细胞培养液后置共聚焦显微镜下观察各组细胞线粒体膜电位染色红绿颜色变化情况。
1.2.5 细胞内SOD含量检测 将细胞接种于10 mm×20 mm细胞培养皿中,贴壁处理后低速离心收集细胞,使用物理破碎细胞方法裂解细胞后测定各蛋白样浓度,将样品稀释至合适浓度后依次加入试剂一至试剂四于96孔板,每孔做两个副孔,于37 ℃细胞培养箱中孵育20 min,使用酶标仪在波长450 nm下测定吸光度值,根据公式计算得出各组SOD含量。
1.2.6 细胞内ROS阳性细胞检测 将细胞接种于共聚焦培养皿中,每孔10×103个细胞,贴壁处理之后加入用无血清培养基1∶1000稀释的DCFH-DA探针,置37 ℃孵箱孵育20 min,弃培养基后用无血清的培养基洗涤细胞3次,加入Hoechst33342避光孵育15 min后用PBS洗涤3次,最后通过共聚焦显微镜观察各组细胞内ROS阳性细胞数。
1.2.7 Western blot检测 将各组细胞弃培养液,胰蛋白酶消化,离心收集细胞,各加入80 μL含PMSF蛋白裂解液RIPA,混匀后冰上裂解30 min,蛋白裂解液充分裂解细胞后,使用高速台式冷冻离心机离心,收集上清液,BCA 法蛋白定量。SDS-PAGE电泳结束后,将蛋白转移到PVDF 膜上,用100 g·L-1BSA封闭1 h,TBST 洗3 次,加入相应稀释度的一抗,4 ℃过夜。第2天TBST洗3次,加入相应稀释度的辣根过氧化物酶标记二抗,室温摇床孵育 1 h;TBST洗3次,ECL显色,扫描记录。以β-肌动蛋白或GAPDH作为内参照。
1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,单因素方差分析进行多组间比较,两两比较采用t检验,P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 青蒿素对ARPE-19细胞增殖和凋亡的影响 MTT法检测不同浓度青蒿素对ARPE-19细胞增殖的影响,结果显示,青蒿素在10~50 μmol·L-1时对细胞均具有增殖作用,在浓度为30 μmol·L-1时对细胞增殖作用最强 (均为P<0.01),见表1。Hoechst33342染色后通过倒置显微镜观察发现,过氧化氢组中凋亡细胞膜破裂,细胞核皱缩,细胞变形;荧光显微镜下凋亡细胞深染,呈高亮度状态。青蒿素预保护组与过氧化氢组相比,细胞增殖率升高,凋亡细胞数显著减少,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见图1和表2。为进一步证实青蒿素对ARPE-19细胞的保护作用,对线粒体膜电位进行检测,细胞膜结构完整时线粒体膜电位染色呈红色,在细胞发生凋亡时细胞膜结构破坏,线粒体膜电位染色呈绿色。青蒿素预保护组与过氧化氢组相比绿色染色减少,红色染色增多,说明青蒿素预保护组凋亡细胞数减少。见图2。





2.2 青蒿素对ARPE-19细胞内SOD含量的影响 与对照组相比,青蒿素组ARPE-19细胞中SOD含量显著增加(P<0.05);与过氧化氢组相比,青蒿素预保护组细胞内SOD含量明显增高(P<0.05),说明青蒿素能增加细胞内抗氧化物质,减少细胞凋亡。见表2。
2.3 青蒿素对ARPE-19细胞内ROS的影响 DC-FHDA荧光探针结合细胞内活性氧物质时使细胞产生高强度绿色荧光,绿色荧光亮度和数量反映各组细胞ROS多少。与对照组相比,青蒿素组ROS阳性细胞减少(P<0.05);与过氧化氢组相比,青蒿素预保护组ROS阳性细胞亦明显减少(P<0.05),说明青蒿素可减少过氧化氢诱导的活性氧物质积聚。见图3和表2。




2.4 青蒿素对ARPE-19细胞内p-AKT及凋亡相关蛋白和Nrf2/keap1蛋白表达的影响 见图4。通过Western blot检测发现,青蒿素能促进ARPE-19细胞内AKT的磷酸化,过氧化氢组ARPE-19细胞内Caspase-3、



PARP、 Keap1相对表达升高,Bcl-2、Nrf2、HO-1降低;青蒿素预保护组ARPE-19细胞内Caspase-3、PARP、 Keap1相对表达降低,Bcl-2、Nrf2、HO-1升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。
3 讨论
        SMD发病机制与脂褐素沉积、补体系统突变、慢性炎症以及氧化应激等因素密切相关。其中氧化应激被认为是最重要的发病原因[5]。研究表明,细胞内代谢产生的过多氧代谢产物堆积造成细胞毒性损伤,从而导致细胞凋亡[6-7]。此外,氧化应激可诱导RPE细胞ROS堆积而造成视网膜功能障碍、结构失调[8]。ROS的大量积聚及RPE细胞对其清除功能的障碍会加重氧化损伤,形成恶性循环[9]。过氧化氢作为一种强氧化剂,被应用于诱导细胞发生氧化应激损伤[10],其诱导的ARPE-19细胞氧化应激模型可用于研究氧化应激对RPE细胞的损伤作用。
        青蒿素是经FDA批准的应用于抗疟疾治疗的一线药物,研究发现,青蒿素具有很好的抗炎、抗肿瘤、抗氧化以及抗病毒等疗效[11]。但青蒿素抗氧化功能作用于视网膜的机制尚未明确。研究表明,在SMD患者中RPE细胞的线粒体DNA受损伤,细胞膜电位传送链缺失增加,说明在视网膜疾病中线粒体功能失调是重要的发病因素[12]。我们用青蒿素预保护ARPE-19细胞,通过观察细胞核形态,并用JC-1探针实验发现,青蒿素可以明显减少过氧化氢造成ARPE-19细胞的线粒体膜电位的缺失。
        SOD可以清除细胞内的氧自由基,使细胞免受氧化应激损伤,对机体和细胞内的氧化还原平衡起着至关重要的作用[13]。用过氧化氢处理ARPE-19细胞,细胞内的SOD含量降低,ROS升高;而用青蒿素预保护后细胞SOD含量明显增高,ROS明显降低。说明青蒿素通过抑制细胞内ROS的积聚减少氧化应激导致的细胞凋亡。由此证明青蒿素可以促进细胞内抗氧化物质含量增加,提高细胞抗氧化应激能力,从而保护细胞免受氧化应激的损伤。Western blot检测相关蛋白发现,青蒿素促进ARPE-19细胞的增殖是通过促进AKT的磷酸化来调节的。青蒿素通过调节Caspase-3、PARP、Bcl-2表达来减少过氧化氢诱导的ARPE-19细胞凋亡。
        Nrf2/HO-1/Keap1通路是重要的抗氧化应激通路[14],Nrf2是一种核转录因子,它的激活或抑制都会引起细胞或动物对应激因素的敏感性增高,这与促癌发生及细胞凋亡等病变过程密切相关[15-16]。在静息状态下,二聚体Keap1与一分子的Nrf2结合,当外界药物或活性氧自由基刺激时,结合域DGR构象发生改变,导致Nrf2从 Keap1 解离并增加Nrf2依赖性基因转移和转录[17]。在过氧化氢诱导的ARPE-19细胞氧化应激中,Keap1表达升高,Nrf2、HO-1表达降低,青蒿素预保护组ARPE-19细胞内Keap1表达降低,Nrf2、HO-1表达升高。由此可见,青蒿素是通过Nrf2/HO-1/Keap1通路激活Nrf2从而提高细胞的抗氧化应激能力。
        青蒿素的抗氧化应激作用可以为临床研究氧化应激损伤提供新依据,为减轻视网膜黄斑变性提供了新的实验基础,同时为SMD提供新的治疗手段。