《眼科新进展》  2019年1期 22-26   出版日期：2019-01-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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葛根素对大鼠糖尿病视网膜病变的抑制作用


        糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病患者眼部最重要的并发症，是糖尿病患者常见的微血管病变之一，主要表现为视网膜部位的神经节细胞凋亡、血管发生神经炎性损伤、血-视网膜屏障损害等多种细胞功能及结构的异常^［1-2］。DR患者可出现视力迅速衰退，甚至失明，严重影响到患者的正常生活，同时为家庭和社会造成了极大的负担。目前，DR的治疗方法主要是视网膜光凝以及玻璃体手术，这仅适用于中晚期患者，虽然可以阻断病情的继续发展，但是无法逆转患者已经出现的视功能损伤。因此，对DR患者的早期干预和治疗具有重要临床意义。葛根是豆科葛属植物野葛或甘葛藤的干燥根，葛根素是从葛根中提取的一种黄酮苷。已有实验研究表明^［3-4］，葛根素具有抑制视网膜新生血管形成的作用，并可改善机体的胰岛素抵抗状态，但具体机制未明。本实验探讨葛根素对2型糖尿病大鼠视网膜病变的作用机制。
1　材料与方法
1.1　动物模型及分组　取SPF级健康Wistar大鼠60只，体质量（300±20）g，购自南京君科生物工程有限公司。饲养于室温（22±2）℃，相对湿度 60%±5%，日照12 h，昼夜循环，自由饮水、进食。将Wistar大鼠随机分为正常对照组20只、模型组20只和葛根素组20只，所有大鼠进行适应性喂养7 d进入实验。
1.2　实验试剂　链脲佐菌素、伊凡斯兰（美国Sigma公司）；葛根素（沈阳格林制药有限公司）；TUNEL细胞凋亡试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司）；磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶（phospho-extracellular signal-regulated kinase，p-ERK）、B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、E2核因子相关因子2（nuclear factor-erythroid 2-related factor-2，Nrf2）、细胞外调节p-ERK的总蛋白（t-ERK）及P53抗体（美国Santa Cruz公司）；肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）及白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA试剂盒（美国Abcam公司）。
1.3　方法
1.3.1　造模及给药处理　参照相关文献报道^［5-6］，结合预实验结果进行实验。模型组和葛根素组大鼠均接受链脲佐菌素左下腹腔注射建立糖尿病模型（链脲佐菌素溶于枸橼酸盐溶液中，配制成pH 4.5的100 g·L^-1链脲佐菌素溶液，按照60 mg·kg^-1的标准进行注射），正常对照组大鼠注射同样体积的枸橼酸盐溶液。链脲佐菌素注射72 h后尾静脉测量血糖（血糖仪测定），若尿糖++++以上，血糖＞16.5 mmol·L^-1，且尿量及饮水显著增多者，视为糖尿病模型制作成功。造模过程中，若出现死亡鼠和血糖恢复鼠，应及时剔除，每组以12只作为最终的实验统计对象。造模后1周，葛根素组大鼠每天给予100 mg·kg^-1葛根素（参照文献报道^［7］，将葛根素注射液的成人一日常用量换算成大鼠的生物等效剂量，并进行预实验确定葛根素的实验用药剂量）单侧腹腔注射治疗，连续治疗6周。正常对照组和模型组大鼠每天给予等量生理盐水腹腔注射。
1.3.2　血糖测量　实验结束后，称大鼠体质量，禁食12 h，断尾取血，采用自动血糖分析仪检测各组大鼠的血糖情况。
1.3.3　检测各组大鼠视网膜屏障损伤情况　于尾静脉处快速注射30 g·L^-1的伊凡斯兰，待2 h之后，给予20 g·L^-1戊巴比妥钠50 mg·kg^-1腹腔注射进行麻醉，待麻醉完全后，轻柔地摘取大鼠的眼球并分离视网膜，分成2份。其中，一部分视网膜浸泡于40 g·L^-1多聚甲醛溶液中，4 ℃保存以备用。另一部分称取晾干之后的体质量，置于300 μL的甲酰胺中，65 ℃下孵育15 h，4 ℃条件下高速离心30 min，留取其上清液，选择波长628 nm测量吸光度（A）值，并取与波长设为740 nm的吸光度之差。
1.3.4　TUNEL法检测神经节细胞凋亡情况　实验结束后，分离视网膜组织，在4 ℃、40 g·L^-1多聚甲醛溶液中固定24 h，将去除眼前节和玻璃体的视网膜组织行石蜡包埋，切片，二甲苯脱蜡，乙醇梯度复水化，PBS洗涤3次后置于1∶200的蛋白激酶K双蒸水中，室温孵育20 min；用双蒸水进行洗涤，重复2次；再加入TdT加荧光素标记dUTP 的反应液，4 ℃孵育过夜；之后加入50 μL的封闭液，在湿盒中37 ℃封闭30 min，PBS洗涤，重复3次，加入DAP，封片采用体积分数20%的甘油缓冲液。在552 nm激发波长及535 nm发射波长条件下，利用荧光显微镜检测绿色荧光，计算凋亡细胞数。
1.3.5　检测各组大鼠视网膜组织中IL-1β、TNF-α、丙二醛和超氧化物歧化酶水平　取部分视网膜组织，制成组织匀浆，采用ELISA法检测各组大鼠IL-1β、TNF-α的水平；采用硫代巴比妥酸法检测丙二醛 （malonaldehyde，MDA）水平；采用黄嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）水平。
1.3.6　Western blot法检测相关蛋白的表达　取部分视网膜组织，加入裂解液提取总蛋白，进行蛋白浓度检测后，进行SDS-PAGE蛋白电泳分离蛋白，转膜，PBS洗涤3次，加入脱脂牛奶封闭1 h，然后加入p-ERK、Nrf2、t-ERK、Bcl-2及P53的一抗，室温孵育过夜，第2天应用TBST洗涤3次。并加入相应的二抗，室温孵育1 h，应用TBST进行3次洗膜。最后进行荧光显色操作。ECL发光法进行显影并采集图像，计算目的蛋白的相对表达量。
1.4　统计学分析　采取SPSS 20.0统计学软件进行数据处理，计量资料以x?±s表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间校正t检验。α=0.05。
2　结果
2.1　各组大鼠体质量和血糖变化　模型组大鼠的体质量低于正常对照组，血糖高于正常对照组（P＜0.05）；而葛根素组大鼠体质量高于模型组，血糖低于模型组（P＜0.05），见表1。



2.2　各组大鼠视网膜屏障损伤情况　模型组大鼠视网膜组织伊凡斯兰渗透量为（10.63±3.21）μg·g^-1，高于正常对照组［（2.87±1.09）μg·g^-1］，差异有统计学意义（P＜0.05）；而葛根素组伊凡斯兰渗透量为（5.56±2.71）μg·g^-1，低于模型组，但高于正常对照组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。
2.3　各组大鼠神经节细胞凋亡情况　模型组大鼠神经节细胞的凋亡指数为16.89±3.19，高于正常对照组（0.92±0.37），差异有统计学意义（P＜0.05）；而葛根素组凋亡指数为7.22±2.08，低于模型组，但高于正常对照组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。
2.4　各组大鼠视网膜组织中IL-1β、TNF-α、MDA及SOD水平比较　模型组大鼠视网膜组织中IL-1β、TNF-α及MDA水平高于正常对照组，SOD水平低于正常对照组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。而葛根素组大鼠视网膜组织中IL-1β、TNF-α及MDA水平低于模型组，SOD水平高于模型组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。见表2。



2.5　各组大鼠Nrf2/ERK信号通路相关蛋白的表达　模型组大鼠Nrf2、p-ERK蛋白的表达水平高于正常对照组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。而葛根素组大鼠Nrf2、p-ERK的表达水平低于模型组，差异均有统计学意义（均为P＜0.05）。各组大鼠t-ERK 的蛋白表达水平差异无统计学意义（P>0.05）。见表3和图1。



2.6　各组大鼠凋亡相关蛋白的表达　模型组大鼠Bcl-2表达水平低于正常对照组，P53高于正常对照组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）；葛根素组大鼠Bcl-2表达水平高于模型组，P53低于模型组，差异均有统计学意义（均为P<0.05）。见表4和图2。





3　讨论
        DR是糖尿病较为常见的微血管并发症之一，具有较高的致盲性，严重影响患者的生活质量，给家庭带来沉重负担。目前，DR的发病机制尚未完全明确，据报道，其发病与血管、炎症、神经等病变密切相关。其中，Nrf2/ERK信号通路介导的炎性反应及氧化应激反应可能在DR发病中发挥重要作用^［8］。Nrf2是一种重要的转录调节因子，可促进过氧化氢酶、血红素加氧酶-1与谷胱甘肽S-转移酶等多种抗氧化应激蛋白基因的转录和表达，从而进一步清除体内产生大量的氧化应激产物和炎性因子，减轻组织器官的炎性损伤。ERK属于丝裂原活化蛋白激酶家族，可激活Nrf2，从而促进多种转录因子的磷酸化来调控细胞的增殖和凋亡。
        炎性细胞因子是上述通路的启动因素。研究表明^［9-10］，DR患者的视网膜中可高表达IL-1β、TNF-α等炎性细胞因子，导致炎性反应及损伤血-视网膜屏障，促进了DR的发生发展。其中，TNF-α主要由巨噬细胞或单核细胞所活化，其表达与血-视网膜屏障的破坏和血管细胞死亡呈正相关，被认为是DR发生炎性反应的启动子，可用于反映DR病情的轻重。IL-1β可在DR的发病进程中发挥重要作用。在DR患者体内，IL-1β可呈高表达，并可促进其他炎性因子的分泌，从而促进细胞黏附分子的表达、钙超载、凋亡途径等过程，促进糖尿病患者的视网膜病变。另外，氧化应激也参与了DR的病变过程^［11］。MDA和SOD是重要的氧化应激的相关指标。MDA是脂质过氧化反应的产物，与氧化应激反应呈正相关。研究表明，糖尿病大鼠氧化应激指标MDA水平显著升高，SOD活性显著降低，提示糖尿病大鼠处于氧化应激状态。因此，控制 DR 的炎性反应和氧化应激损伤是治疗 DR的重要手段之一。
        本研究结果显示，模型组大鼠视网膜组织中IL-1β、TNF-α及MDA水平高于正常对照组，SOD水平低于正常对照组，且模型组大鼠Nrf2及p-ERK蛋白的表达水平高于正常对照组。而模型组大鼠的 Bcl-2 水平显著降低，P53、Nrf2、p-ERK水平显著增加。提示DR大鼠的视网膜发生了显著的炎性反应及氧化应激损伤，上述反应可能与Nrf2/ERK信号通路的激活有关。
        葛根素是从中药葛根中提取的异黄酮类成分。已有研究表明^［12-13］，葛根素可显著抑制视网膜新生血管形成，并保护视网膜免受缺氧造成的损害，提示葛根素可能是治疗DR的有效药物，但具体作用机制尚未阐明。本研究结果显示，模型组大鼠的体质量显著低于正常对照组，血糖水平、视网膜组织伊凡斯兰渗透量及神经节细胞的凋亡指数显著高于正常对照组，且 Bcl-2表达水平显著降低，P53表达水平显著增加。提示DR大鼠视网膜细胞凋亡显著增加，且发生了增生性病变，这与文献报道相一致^［11］。但葛根素组大鼠血糖、视网膜组织伊凡斯兰渗透量及神经节细胞的凋亡指数显著低于模型组，Bcl-2水平高于模型组，P53水平低于模型组。提示葛根素可有效控制大鼠的血糖，减轻视网膜屏障损伤，抑制视网膜神经节细胞的凋亡。
        另外，本研究结果显示，葛根素组大鼠Nrf2、p-ERK的表达水平低于模型组。葛根素组大鼠视网膜组织中IL-1β、TNF-α及MDA水平也低于模型组，SOD水平显著高于模型组。提示葛根素可能通过抑制Nrf2/ERK信号通路，减轻DR的炎性反应及氧化应激损伤，对视网膜细胞具有保护作用。
        综上所述，葛根素应用于2型糖尿病的视网膜病变中，可有效抑制视网膜细胞的炎性反应和氧化应激损伤，发挥保护视网膜神经节细胞的作用，其机制可能与抑制Nrf2/ERK信号通路的激活有关。由于本研究属初步研究，仅设立了葛根素单剂量组进行疗效观察，未设立高、中、低剂量组，实验设计上存在一定的不足，后续将进一步探讨不同剂量葛根素对DR的疗效和治疗作用。