《眼科新进展》 2018年12期
1196-1200
出版日期：2018-12-05
ISSN:1003-5141
CN:41-1105/R
糖尿病视网膜血管病变中未折叠蛋白反应：蛋白质折叠的意义和治疗潜力
糖尿病（diabetes mellitus，DM）已成为全球最具挑战性的健康问题之一。据估计，2011年全球有3.66亿DM患者，预计到2030年这一数字将增加至5.52亿［1］。虽然良好的血糖控制已被证明可以显著降低微血管并发症的发生率，但是只有17％的患者能够达到将糖化血红蛋白（HbA1C）降至低于7％的目标，即使采用强化代谢控制，多达20％的患者在患DM 30 a后也会发生增殖性糖尿病视网膜病变（proliferating diabetic retinopathy，PDR）［2］。因此，了解DM视网膜损伤的发病机制至关重要。研究表明，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）参与了DM及其并发症的发病机制，视网膜细胞中ERS的增加和未折叠蛋白反应（unfold protein response，UPR）的激活促进了糖尿病视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）的主要病理生理性事件，如氧化应激、炎症、细胞凋亡、血管渗漏和血管生成［3-4］。本文将对UPR在DM视网膜血管病变中蛋白质折叠的意义和治疗潜力的研究进展进行综述。
1 UPR
内质网是中心蜂窝状细胞器，主要负责蛋白质折叠、组装以及运输，当细胞受到体外不同强度刺激后，内质网将产生未折叠或者错误折叠蛋白堆积，诱发内质网产生不同程度的ERS ［5］。为了保证蛋白质的正确折叠，内质网精密识别异常蛋白并使之重新折叠或清除，这个过程被称为UPR。UPR致力于通过调节内质网相关蛋白降解、蛋白质翻译、蛋白质折叠，以减少ERS并恢复内质网稳态。然而，长期的ERS超出了UPR的处理能力时，内质网的动态平衡将不能重新建立。在这些情况下，UPR将从适应转变为诱导细胞死亡的促凋亡作用，以去除严重受压和不健康的细胞。UPR信号通路主要通过3种ERS感受器介导激活。ERS感受器属于跨膜蛋白，包括活化转录因子6 （activating transcription factor 6，ATF6）、1型ER 转膜蛋白激酶（type-1 ER transmembrane protein kinase，IRE-1） 以及双链RNA 依赖蛋白激酶样ER 激酶（PKR likeendoplasmic reticulum kinase，PERK）。三者与内质网分子伴侣GRP78 （glucose-regulated protein78） 结合而处于非活化状态。应激条件时，GRP78 从内质网腔表面脱离，引发上述3 种感受器蛋白的自我磷酸化和二聚化，从而引起UPR 的发生。研究表明，内质网功能障碍和内质网应激参与到DM及其并发症的发病机制中，并且在各种各样不同的疾病中，UPR信号和血管生成过程之间的相互作用是显而易见的，如肿瘤、视网膜新生血管、动脉硬化、缺血性肾脏病。对UPR在DR血管生成中的作用的认知可能导致新的治疗药物产生，并且通过抑制血管生成特定的ERS介质来达到治疗的目的。
2 UPR与DR
DR是一种常见的DM微血管并发症，其特征表现为血管功能障碍、通透性增加、炎症、血管变性和新生血管形成［6］。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的上调被认为是血-视网膜屏障功能障碍的主要介质，它可能发生在DR的任何阶段，也可发生在新生血管生长晚期。VEGF是通过调节内皮细胞的增殖、迁移和管腔形成促进血管生成的一种重要的生长因子，也被称为血管通透性因子（vascular permeability factor，VPF），比组胺诱导血管通透性强50×103倍。此外，VEGF是一种有效的促炎症因子和上调内皮细胞的黏附分子。应用VEGF siRNA（small interfering RNA）抑制VEGF的表达，利用VEGF中和抗体或VEGF受体嵌合蛋白阻断VEGF活性，均可成功抑制DM视网膜炎症、血-视网膜屏障破裂和血管渗漏［7］。因此，VEGF被认为是血管损伤和黄斑水肿的关键介质。在体外研究中，ERS在1型DM动物模型的视网膜中表达增加［8］，玻璃体腔注射衣霉素诱导ERS可以使小鼠视网膜VEGF表达增加。同时，视网膜血管内皮细胞和Müller细胞暴露在衣霉素或毒胡萝卜素诱导的ERS中，使得VEGF表达显著增加［9］。相反，在体外培养的DR视网膜细胞以及氧诱导小鼠视网膜缺血模型（oxygen induced ischemic retinopathy，OIR）中，ERS减少可以降低VEGF的产生。研究者使用各种方法在DM大鼠视网膜中检测出GRP78表达的增加和磷酸化表达，并得出在DR中有3条UPR通路参与其中，分别为IRE1-XBP1通路、PERK-eIF2α-ATF4-CHOP通路以及ATF6通路。这3条通路激活UPR所产生的差异可能与DM模型的差异有关，如DM病程、动物种类和菌种，以及用于检查的UPR方法。此外，这些研究在DR中提供ERS激活UPR的相关证据［10］。
许多研究虽然试图探讨UPR通路在DR发病机制中的作用，但是这些研究大部分都集中在通过动物模型培养的视网膜细胞中IRE1-XBP1和PERK-eIF2α-ATF4-CHOP UPR通路，在视网膜Müller和血管内皮细胞，高血糖足以引起ERS，并激活IRE1和PERK通路。然而，在视网膜周细胞中，只有波动的血糖浓度而不是慢性（常量）高血糖才能诱导ERS。减少ERS化学分子伴侣的治疗，如4-苯基丁酸盐或牛磺熊去氧胆酸，可抑制高血糖引发的血糖波动导致炎症因子过表达，提示高血糖引起ERS并诱导视网膜细胞炎症因子产生。研究发现，对于通过ERS或者是高糖视网膜Müller细胞感应HIF-1和VEGF的分泌，激活ATF4是必不可少的。ATF4活性的基因抑制减轻DM诱导的视网膜炎症和血管渗漏，这表明在DR中上调ATF4有助于视网膜炎症和内皮屏障功能障碍的发生。同时，严重氧化和糖化低密度脂蛋白通过氧化应激和ERS能诱导CHOP凋亡，并引起周细胞丢失［11］。因此，在DR中诱导ATF4/CHOP途径可能引起周细胞丢失和血管变性，然而这种猜测需要通过使用合适的DM动物模型进一步研究证实。
最后，虽然在DR中对于ERS和UPR的激活有很多的证据，但是目前尚不清楚UPR通路是否在晚期DM中参与视网膜新生血管的形成。这主要是由于目前可用的DM动物模型的局限性［12］。而几乎所有的DM动物模型的视网膜血管变化发展大多数模拟非增殖性DR的早期症状，除了最近报道的Akimba小鼠用于研究人类疾病如视网膜新生血管以及与新生血管相关增殖性改变。通过建立Akita小鼠1型DM模型与Kimba小鼠（VEGF+/+） 瞬时过表达光感受器细胞的VEGF相交叉的Akimba小鼠视网膜血管和神经退化更严重［13］。但该模型自2010年以来一直未被广泛应用于该领域，目前尚未对DR的分子基础进行检测。最近的一项研究显示转录因子7 2（TCF7L2）在人体PDR中存在遗传相关联［14］。在细胞表达的风险等位基因（rs7903146 TT）中，诱导ERS可导致TCF7L2和VEGF高表达。这证明rs7903146 TT患者的视网膜细胞可能对ERS上调VEGF的表达比健康人更敏感，并可能会有较大的机会发展为PDR。
3 在血管生成过程的调控UPR信号
3.1 IRE-1和血管生成 近日，IRE-1/XBP1通路已被证明有助于血管生成和肿瘤生长，这个UPR分支在新生血管中发挥潜在的调控作用［15-16］。Drogat等［17］得出缺氧诱导肿瘤血管生成的过程中需要IRE-1α的参与［17］。肿瘤细胞表达的显性负IRE-1α转基因以及IRE-1α基因缺失小鼠的胚胎成纤维细胞对于氧和葡萄糖剥夺（缺氧和低血糖模型）中的任何一个都无法触发上调VEGF的表达。这一发现首次建立在IRE-1活性和VEGF表达上调功能上的联系。此后，大量证据证实IRE-1作为肿瘤生存和转移、胎盘发育和胚胎生存能力的关键调节因子所扮演的重要作用。尽管更多的PERK/eIF2α和 ATF6信号通路的激活以及HIF-1α表达水平增加，IRE-1α缺失的小鼠表现出VEGF低表达以及在胎盘血管中的生成障碍［18］。此外，抑制XBP1对胎盘VEGF表达水平无影响，提示IRE-1α对VEGF的调节作用与XBP1相互独立。Ghosh等［19］使用IRE-1α-/- 和PERK-/-小鼠胚胎成纤维细胞ATF6α-抑制HEPG2细胞，通过ERS诱导VEGF-A mRNA与对照组相比表达衰减。在IRE-1α-/-和PERK-/-细胞中，IRE-1α和PERK通路的激活也抑制了VEGF-A mRNA表达的衰减。这些结果表明，这些UPR分支参与了VEGF的生产调节。
除了调节XBP1剪接，激活IRE-1α可使其具有激酶活性和招募TRAF2的能力，同时反过来激活应激激酶，例如JNK和IκB（κB抑制剂）激酶（IKK）［20］。这些激酶已被证明发挥促血管生成作用，而且不依赖于XBP1剪接。剪接XBP1 mRNA，激活IRE-1α降解micro-RNA以及mRNA借助于具有核糖核酸内切酶活性的其他基因降解。除了VEGF-A，受损的IRE-1活动导致在几个强有力的促血管生成因子表达多方面的减少，包括IL-1、IL-6和IL-8β。此外，IRE-1α调节一个小的非编码RNA分子家族，协调促进和抑制血管生成因子的表达来调节血管生成。在神经视网膜中，缺氧激活IRE-1α降低神经生长因子-1 mRNA的表达，调节巨噬细胞/小胶质细胞的促血管生成特性，从而导致视网膜血管再生障碍，增强病理性新生血管［21］。相反，IRE-1α的siRNA敲除可显著降低VEGF激活的视网膜内皮细胞管形成和小鼠模型中的脉络膜视网膜病变［22］。这些数据共同表明它在血管生成的调控作用，包括其激酶和核糖核酸内切酶域。未来的研究需要更好地理解IRE-1α激酶活性所扮演的截然不同的角色，从它的核糖核酸内切酶活性进一步剖析IRE-1α下游通路的介导在血管内皮细胞中的促血管生成作用。将一个或一些这样特定的IRE-1α活动作为目标，可能为病理性新生血管的干预治疗提供新的途径。
3.2 XBP1和血管生成 XBP1作为调节B淋巴细胞成熟的重要转录因子首次被发现，并在过去的 20 a 中，XBP1附属的和新的功能陆续被更多地披露和揭示。在早期肿瘤生长血管生成中，XBP1是必不可少的，通过小鼠胚胎成纤维细胞和人纤维肉瘤细胞中shRNA抑制XBP1表达来降低肿瘤血管的形成，而剪接XBP1的表达（XBP1s）可在缺乏功能型IRE-1α细胞中恢复血管生成。据报道，ERS通过IRE-1α/ XBP1途径而不是通过ATF6途径介导使得VEGF表达上调［23］。此外，在VEGF-A基因的启动子，通过染色质免疫共沉淀（ChIP）分析还证明拼接XBP1可结合两种不同的体系。这些结果说明通过在不同的细胞和组织，以及不同的生理条件下，可能会有不同的多个上游基因及其共同因子调节VEGF表达的复杂本质。
尽管其可能与VEGF的启动子区结合，并且在小鼠胚胎纤维母细胞和视网膜色素上皮细胞中调节转录，XBP1S的促血管生成作用似乎是独立的［24］。然而，究竟如何调节内皮细胞活性和XBP1的血管生成过程仍然知之甚少。为了验证XBP1对血管内皮细胞的影响，有观察学者用内皮细胞特异性XBP1基因敲除的小鼠（xbp1ecko）对缺血作出的反应，结果表现为血管生成受损。
相反，XBP1具有促血管生成作用，Nakamura等［25］用低剂量的ERS诱导剂，如衣霉素或毒胡萝卜素，增加视网膜血管内皮细胞迁移增殖和诱导视网膜新生血管生成，而这其中并没有激活XBP1。通过caspase依赖途径激活的血管内皮细胞的凋亡基因持续活化，抑制VE钙黏蛋白转录，增加beclin-1介导的自噬［26］。有研究通过抑制VEGF激活VEGF受体1（VEGFR1）和VEGF受体2（VEGFR2），衣霉素诱导UPR可上调TSP-1（一种内源性血管生成抑制剂），并且在体外和体内抑制血管生成。过表达XBP1基因抑制视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和管道的形成，抑制VEGF体外活性VEGFR2信号通路，并抑制体内的OIR小鼠视网膜新生血管形成。这表明在UPR通路可调节促血管生成和抗血管内皮细胞表达血管生成信号。进一步深入研究血管生成过程中调控UPR的基因可能能够确定潜在的和迄今未知的调节视网膜缺血和新生血管的发病机制。
3.3 PERK/eIF2α和血管生成 除了IRE-1通路，PERK/ATF4-UPR的另一个分支也参与了血管生成的调控。例如，PERK已被证明在低氧环境下是肿瘤细胞促血管生成转录的一个子集，如VEGF和1型胶原诱导蛋白、促进肿瘤细胞黏附、铺展和整合素结合的黏附蛋白［27］。肿瘤来源于K-Ras-transformed PERK-/-小鼠胚胎成纤维细胞，体积较小，并且具有完整的综合应激反应的肿瘤表现出更少的血管生成。这些发现表明PERK在血管生成中所发挥的作用。在ERS中，激活PERK磷酸化eIF2α反过来又有助于激活核因子κB——一个调节增生性视网膜疾病的血管生成和炎症强有力的转录因子。
3.4 ATF4和血管生成 与PERK、eIF2α、ATF4相比，PERK/eIF2α通路的下游效应关于血管生成和VEGF调节得到了更为广泛的研究。在高血糖、缺氧和氧化磷脂条件下，内皮细胞激活ATF4。激活的ATF4转录上调VEGF和IL-6、IL-8、MCP-1、CXCL3。在视网膜中，减少ATF4表达可以减轻DM引起的视网膜炎症和血管渗漏，并且在OIR中减轻视网膜新生血管的形成。ATF4与多个信号通路分子交叉，参与血管生成，如STAT3、HIF-1α和JNK。在视网膜色素上皮细胞中，氧化磷脂刺激产生VEGF在很大程度上依赖于ATF4［28］，它直接与酰基氨基酸释放酶结合参与调控VEGF的表达。在视网膜Müller细胞，ATF4可以诱导JNK的活化，并且JNK的抑制作用减弱ATF4介导的VEGF上调。此外，在ERS与缺氧时，ATF4进一步稳定HIF-1α，在这些条件下，HIF-1α活化和VEGF表达是必不可少的。ERS诱导ATF4与HIF-1具有协同功能，这主要是缺氧激活所致，并使VEGF表达上调［29］。此外，一些新的分子最近被确定为参与ATF4介导的血管生成，包括芳香烃受体（AhR）、核因子红系相关因子2（Nrf2）和一般性调控阻遏蛋白2 （GCN2）激酶［30］。因此，这些研究结果指出了一个联动的ATF4在UPR和不同的促血管生成通路之间形成广泛的相互作用。
与其促血管生成的作用相反，ATF4通过诱导CHOP促进内皮细胞死亡，主要通过促凋亡基因介导ERS相关细胞凋亡，CHOP激活Caspase-3、4，并与其他抗凋亡分子相互作用，共同调节细胞凋亡程序［31］。在这些情况下，PERK/p-eIF2α/ATF4成为一个非常重要的UPR通路，它可以导致内皮细胞凋亡和血管变性［32］。在不同的细胞类型或暴露在不同的应力诱导剂之中，ATF4可以激活不同的下游信号通路，从而对细胞存活、增殖和迁移产生不同的影响。这可能在DR中通过ATF4的激活导致血管变性以及新生血管的形成。
3.5 ATF6和血管生成 ATF6包装和转运到高尔基体，而不是留在ER中，并且它是通过细胞质发挥效应的。分解ATF6，可以得出它是一种碱性亮氨酸拉链（bZIP），含有转录因子，进入细胞核内与ERS相关元件编码ER伴侣、酶和转录因子的启动子结合，如GRP78、GRP94和蛋白质二硫键异构酶。在内皮细胞高血糖、过氧化氢和氧化脂质诱导下，ATF6可以激活VEGF，并参与细胞增殖和炎症，ATF6通过结合启动子增加VEGF的转录。Ruan等［33］证明，敲除ATF6基因可以使内皮细胞血管生成降低50%，有效抑制乳腺癌异种移植模型血管生成。Liu等［34］的研究中观察到了类似的效果：减少ATF6表达可降低VEGF诱导的视网膜血管内皮细胞小管形成。研究发现，ATF6作用于OIR或脉络膜新生血管（choroidal neovascularization，CNV）模型小鼠的siRNA，导致约35%的血管生成减少，当与VEGF中和抗体结合时，可以进一步实现25%~40%的减少。
相比于其他UPR通路的两个分支，虽然其下游靶蛋白被确认为血管生成的关键因素，但是目前对ATF6调节血管生成的了解仍然是有限的。例如，GRP78是一种肿瘤增殖、存活和血管生成的关键调节因子。Dong等［35］发现在GRP78基因的杂合条件下（GRP78+/-），GRP78表达水平降低约一半，这对器官发育和抗体的产生没有影响，但显著抑制小鼠肿瘤的生长，部分通过大幅降低肿瘤微血管密度从而降低肿瘤的生长。除了ER保留GRP78以外，细胞表面GRP78受体表达功能可增强生长因子信号和凋亡信号转导。从内质网到细胞表面GRP78的募集是通过ERS诱导促进的。GRP78与质膜锚定蛋白相互作用，并且定位于内皮细胞表面，如电压依赖性阴离子通道。这种相互作用被认为是一种潜在的机制，在DR中促进内皮细胞增殖，抑制细胞凋亡，并在应激条件下防止血管损伤。GRP78也通过增加Akt的磷酸化促进生存［36］。总之，ATF6是调节UPR应答基因的一个子集，并已作为亲和或抵抗血管生成因子。但ATF6的附加功能仍有待确定。
4 小结
就目前的研究成果来看，DR是一种以原位内皮细胞功能障碍和凋亡为主的初始改变，并随着时间的推移使得血管变性，最终导致缺血和血管生成的一种疾病。总结以上得出，在DR视网膜血管发育、血管变性以及病理性新生血管的生成中，UPR扮演了重要角色。然而，大部分的研究都集中在VEGF对于UPR的影响。与之相反的是，关于UPR是如何调节其他血管生成因子的报道甚少。此外，DR发展过程中也伴随着全身内环境的改变。今后应考虑多因素协同作用对治疗DR所产生的影响，这对未来寻求新的治疗靶点可提供更多的可能。