《眼科新进展》  2018年12期 1133-1136   出版日期：2018-12-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
雷公藤甲素对人视网膜色素上皮细胞氧化损伤的抑制作用


        视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelial cells，RPE）层位于视网膜神经上皮层与脉络膜Bruch膜之间，其特殊位置决定了在视网膜、脉络膜疾病中的重要作用［1］。当机体的抗氧化防御屏障功能破坏时，会产生大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS），ROS生成与中和失衡会对RPE细胞造成不可逆性损伤［2］。雷公藤甲素具有良好的抗氧化、抗炎及抗癌活性，许多实验研究已经将雷公藤甲素用于多种眼部疾病的治疗，如治疗葡萄膜炎、预防角膜移植排斥反应、防治脉络膜新生血管形成、治疗青光眼术后滤过泡纤维化等［3-6］，均取得满意疗效。但对RPE细胞的影响如何未见相关报道。本研究通过制备RPE细胞氧化损伤模型，观察雷公藤甲素对RPE细胞的保护作用，并对其机制进行初步探讨，以期为视网膜病变的治疗提供一定的理论依据。
1　材料与方法
1.1　材料　雷公藤甲素（成都普思生物科技有限公司），H2O2（美国Sigma公司），MTT试剂盒（上海伯奥生物制品公司），H2DCFDA染色试剂盒（上海贝博生物公司），Hoechst 33258试剂盒（南京建成生物研究所），BCA蛋白测定试剂盒、PVDF膜及化学发光试剂（上海碧云天公司），超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）抗体 （上海碧云天公司）。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养　将冻存的RPE细胞（传代培养，购买于上海瑞齐生物有限公司）复苏，接种于含体积分数10%胎牛血清、100×103 U·L-1青霉素、100×103 U·L-1链霉素的DMEM培养液的细胞培养瓶中，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的孵箱培养，每3 d 更换1次培养液，待细胞生长融合至80%时进行传代，加入2.5 g·L-1胰蛋白酶37 ℃消化传代。以109个·L-1细胞密度接种于新的培养瓶内，选择第3～5代细胞用于实验。
1.2.2　药物处理及实验分组　共分4组：（1） 对照组：不做任何处理；（2）氧化损伤组：100 μmol·L-1 H2O2孵育RPE细胞24 h；（3）雷公藤甲素低浓度组：100 μmol·L-1雷公藤甲素孵育RPE细胞24 h后加入100 μmol·L-1 H2O2孵育12 h；（4）雷公藤甲素高浓度组：200 μmol·L-1雷公藤甲素孵育RPE细胞24 h后加入100 μmol·L-1 H2O2孵育12 h。
1.2.3　MTT法测定细胞增殖　取出处于对数生长期的RPE细胞接种于96孔板中，细胞密度为10×109个·L-1，每孔200 μL，向各孔细胞中加入10 μL MTT（5 g·L-1），4 h 后吸出上清液，加入100 μL DMSO溶液，低速振荡10 min后在酶联免疫检测仪上测定各孔570 nm的光密度（A）值，细胞存活率=（A实验组-A空白组）/（A对照组-A空白组）×100%，设定加入细胞和MTT溶剂的孔作为对照组，加入相应量细胞培养液、药物和MTT溶液但没有加入细胞的孔作为空白组。
1.2.4　流式细胞技术检测RPE细胞内ROS含量　RPE细胞接种于6孔培养板，1 g·L-1胰蛋白酶（不含EDTA）消化各组细胞后制备细胞悬液。1000 r·min-1离心后收集细胞，加入5 μL H2DCFDA染料后充分混匀后避光反应15 min，于1 h内用流式细胞仪检测细胞内ROS含量变化。
1.2.5　Hoechst 33258染色观察细胞凋亡　Hoechst33258 是一种与DNA结合的蓝色荧光染料，常用于细胞凋亡的检测。Hoechst 33258染色剂能透过胞膜完整的细胞，嵌入细胞核DNA使之发出明亮的蓝色荧光。非凋亡细胞呈现均匀一致的低蓝色荧光特征。凋亡的细胞核染色增强，染色质浓缩、边集，呈团块状，可见核碎片。RPE细胞接种于12孔培养板，细胞经相应处理后用PBS洗涤2次，在150 μL 的Binding Buffer中加入2 μL Hoechst染液，避光、室温反应5 min后置于荧光显微镜下观察结果并拍照。细胞凋亡率＝凋亡细胞数/总细胞数×100%。
1.2.6　Western blot检测　RIPA裂解液提取总蛋白后，用BCA蛋白测定试剂盒测定浓度，取等量的上样蛋白加入已配好的SDS凝胶中，电泳分离蛋白后用PVDF膜转膜，脱脂奶粉液封闭漂洗后分别加入一抗、二抗，采用增强化学发光法曝光显影并扫描灰度。
1.3　统计学分析　采用SPSS 18.0统计学软件对实验数据进行统计分析。结果采用x?±s表示，多组比较采用One-way方差分析，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　雷公藤甲素对RPE细胞存活率的影响　MTT结果显示，雷公藤甲素对RPE细胞活性没有明显影响，对照组细胞存活率为101.00%±3.32%，雷公藤甲素低浓度组细胞存活率为100.00%±2.41%，雷公藤甲素高浓度组细胞存活率为100.61%±2.53%，3组比较差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2　雷公藤甲素对H2O2损伤RPE细胞存活率的影响　MTT结果显示，氧化损伤组RPE细胞经H2O2处理后，细胞存活率（32.67%±3.08%）明显下降，与对照组（97.97%±2.34%）比较差异具有统计学意义（P<0.01）。用100 μmol·L-1、200 μmol·L-1雷公藤甲素处理后，RPE细胞存活率分别提高到 56.00%±2.76%和70.33%±3.85%，与氧化损伤组相比差异具有统计学意义（P<0.05）。
2.3　DCFH-DA荧光探针检测各组RPE细胞内ROS 变化　采用DCFH-DA荧光探针检测RPE细胞内ROS变化显示，对照组细胞内ROS含量均较低，氧化损伤组DCF荧光信号明显增强，不同浓度雷公藤甲素干预后，荧光信号强度逐渐减弱（图1）。



2.4　Hoechst-PI双染核染色法观察各组RPE细胞凋亡　氧化损伤组凋亡细胞数量增多，细胞凋亡率为（67.00±3.42）%，雷公藤甲素干预后，凋亡细胞逐渐减少，雷公藤甲素低浓度组细胞凋亡率为（50.33±4.61）%，雷公藤甲素高浓度组细胞凋亡率为（46.67±4.73）%，与氧化损伤组比较差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。



2.5　Western-blot检测雷公藤甲素对RPE细胞内SOD、MDA表达的影响　氧化损伤组RPE细胞中SOD蛋白表达量显著低于对照组，MDA蛋白表达量显著高于对照组（均为P<0.01）；雷公藤甲素组RPE细胞中SOD蛋白表达量显著高于氧化损伤组，MDA蛋白表达量显著低于氧化损伤组（均为P<0.05）。见图3和表1。




3　讨论
        RPE细胞构成视网膜外屏障，对保护视力、营养视网膜发挥重要作用，其生理功能包括避光、构成血-视网膜屏障、清除自由基、转运营养成分、储存转运视黄醛、吞噬降解光感受器外节段等［7］。RPE细胞对氧化应激损伤敏感，而且一旦死亡便不能再生，因此，其结构与功能完整对维持视网膜正常功能至关重要［8］。为了研究视网膜病变的发生机制并探索出更多的治疗性药物，国内外学者尝试了大量方法诱导RPE细胞凋亡，如高糖、化学药物、H2O2等。为了能更接近人体环境，本研究模拟人体内环境中RPE细胞的氧化应激状态，利用100 μmol·L-1 H2O2建立细胞氧化损伤模型，观察雷公藤甲素对RPE细胞的保护作用。
        随着年龄增加及环境因素改变，人体不断接受内外环境氧化因素攻击，积累性氧化损伤导致组织凋亡，在眼部可以表现为白内障、年龄相关性黄斑变性。ROS包括H2O2、超氧阴离子、羟自由基等，生理含量的ROS对维持正常生命活动是必不可少的［9］。在氧化应激状态下，机体抗氧化能力下降，线粒体氧化磷酸化功能障碍导致ROS大量释放，引起线粒体呼吸链功能下降；过量生成的ROS可直接或间接通过损伤线粒体DNA导致线粒体呼吸链功能受损，进一步促使ROS的释放，最终形成恶性循环并加速细胞的凋亡［10］。长时间大量堆积的ROS直接损伤RPE细胞，导致视功能障碍。
        雷公藤甲素本身即为一种活性很高的环氧化二萜内酯化合物，能有效清除ROS。环氧化酶2是诱导型环氧化酶，可由ROS以及炎性因子诱导产生。代玉桥等［11］研究结果显示，雷公藤甲素对中枢神经系统中脂多糖诱导的环氧化酶2的表达有明显的抑制作用。本研究也是考虑到雷公藤甲素较强的抗氧化及抑制凋亡作用，将它作用于体外培养的RPE细胞。
        国内外关于雷公藤甲素保护视网膜的研究报道并不多见，谭蔚等［12］研究显示，雷公藤甲素通过下调视网膜胶质纤维酸性蛋白及单核细胞趋化因子-1的表达，减轻视神经的炎症反应及视网膜神经节细胞凋亡。本研究结果显示，雷公藤甲素能够有效抑制H2O2引起的RPE细胞内ROS增加，说明雷公藤甲素具有抑制RPE细胞氧化损伤的作用。随着雷公藤甲素浓度增加，RPE细胞增殖率逐渐增加，凋亡率逐渐降低，表明雷公藤甲素能够抑制RPE细胞凋亡的发生，并且与药物浓度相关。SOD、MDA是机体内主要的抗氧化酶，其中SOD与自由基清除能力有关，MDA含量高低可反映自由基水平［13］。在本实验中，雷公藤甲素作用于RPE细胞后，SOD表达相对于氧化损伤组增高，MDA表达相对于氧化损伤组降低，提示雷公藤甲素通过改变抗氧化酶表达抑制了RPE细胞凋亡。
        雷公藤甲素的细胞毒性被公认为低于化学合成药物，被广泛用于多种全身疾病的治疗，鉴于其临床应用的有效性及安全性，雷公藤甲素有望为视网膜病变的治疗提供新的药物选择。