《眼科新进展》  2018年12期 1129-1132   出版日期：2018-12-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

---

视网膜色素变性Rd1小鼠眼球中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达


        视网膜色素变性（retinitis pigmentosa，RP）是一类以进行性感光细胞和视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial，RPE） 细胞功能丧失为特征的遗传性营养不良性退行病变，表现为夜盲和视野缩窄^［1］。RP具有高度的遗传异质性，其确切病因不明，发病早，进展缓慢但不可逆，全球发病率约为1/4000^［2］，在我国发病率约为1/3467^［3-4］。目前研究RP的主要动物模型为Rd小鼠^［5］，该小鼠是由pde6b基因缺失所致^［6］，其编码PDEβ亚单位，发生突变时引起 PDE 功能异常，光传导链被切断，最终导致光感受器细胞凋亡^［7］。Rd小鼠视锥细胞的存活时间比视杆细胞长，随着病变的发展，视网膜细胞层逐渐发生变性^［8-9］。在美国的RP患者中4%~5%是由pde6b基因突变引起的。本研究选择C57BL/6J小鼠作对照，该品系最主要的两个特点就是品系稳定和易于繁殖。另外C57BL/6J小鼠也是第一个完成基因组测序的小鼠品系，常作为生理学与病理学研究的实验动物模型^［10］。
        增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是真核细胞DNA合成所必需的一种核蛋白，主要存在于DNA复制或DNA合成的起始阶段，在DNA合成和细胞分裂周期中起重要作用^［11-13］，因为它也是存在于细胞核中的细胞周期调控蛋白，与细胞周期蛋白、细胞周期依赖性激酶和细胞周期依赖性激酶抑制蛋白相互作用，调控细胞周期各个时相的转换^［14］。由于其在增殖细胞S期表达量达到峰值，因此被作为检测细胞增殖状态的一个重要指标 ^［15］。本研究以Rd小鼠作为研究对象，以C57BL/6J小鼠为对照，研究其视网膜发育阶段以及两种小鼠间视网膜形态结构及PCNA表达的差异。
1　材料与方法
1.1　实验动物　本研究实验动物为野生型C57BL/6J小鼠和Rd1小鼠，均购自南京大学生物研究所，并在内蒙古医科大学分子病理学重点实验室配种，循环光照（光照12 h，黑暗12 h），在25 ℃无菌环境下饲养。
1.2　实验试剂　PBS缓冲液、柠檬酸缓冲液、DAB显色剂、即用型免疫组织化学试剂盒、抗体PCNA（1∶50）、超纯组织RNA提取试剂盒、反转录试剂、荧光定量PCR试剂。
1.3　方法
1.3.1　HE染色以及免疫组织化学染色　将出生后14 d、21 d、28 d的Rd1和C57BL/6J小鼠各5只，断颈处死，取出眼球放入甲醛溶液中浸泡24 h，然后将其房水扎破后浸蜡。全自动脱水机ASP200进行脱水、使眼球矢状面向上包埋、切片。常规HE染色以及免疫组织化学染色。
1.3.2　实时荧光定量PCR检测　取出生后14 d、21 d、28 d的Rd1小鼠和C57BL/6J小鼠双侧眼球，参照超纯组织RNA提取试剂盒（天根试剂）说明书提取PCNA mRNA，用NanoDrop2000C测定其浓度；以2 μg 总RNA为模板进行逆转录反应。引物设计采用primer 5.0 软件，委托上海生工生物公司合成。引物：PCNA：上游引物：5’-TTTGAGGCACGCCTGATCC-3’，下游引物：5’-GGAGACGTGAGACGAGT-CCAT-3’，片段长135 bp；内参GAPDH：上游引物：5’-AGGTCGGTGTGAACGATT-TG-3’，下游引物：5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’，片段长150 bp。用SYBR Green Master Mix 荧光染料进行相对定量PCR 检测，反应条件为：95 ℃预变性5 min，循环反应40次（95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s）。实时荧光定量PCR 结果采用2^-ΔΔCt法分析，其中ΔΔCt=（Ct_目标基因-Ct_内参基因） _样本-（Ct_目标基因-Ct_内参基因） _对照。
1.4　统计学分析　本研究数据采用x?±s表示，利用SPSS 10.0统计软件进行t检验。两种小鼠及不同发育阶段PCNA的表达采取两因素方差分析，α=0.05。
2　结果
2.1　常规HE染色结果　HE染色结果显示，PCNA蛋白均在两种小鼠视网膜神经节细胞中表达；C57BL/6J小鼠视网膜结构完整（图1）；与C57BL/6J小鼠相比，Rd1小鼠视网膜发育随着鼠龄的增加，发生进行性退化（图2）。




2.2　免疫组织化学染色结果　免疫组织化学染色结果显示，PCNA蛋白表达仅局限于视网膜神经节细胞，免疫阳性信号出现在第14天和第21天，而在第28天未检测到；随着鼠龄的增加，PCNA蛋白的表达在C57BL/6J小鼠和Rd1小鼠中无显著差异（图3）。



2.3　PCNA基因在不同发育阶段Rd1小鼠眼球中的表达　PCR实验结果显示：与C57BL/6J小鼠相比较，鼠龄21 d时Rd1小鼠PCNA基因表达水平增高，是C57BL/6J小鼠的2.23倍（图4）；鼠龄14 d和 28 d 时 Rd1小鼠PCNA基因表达均低于C57BL/6J小鼠（均为P<0.05）。



3　讨论
        正常小鼠眼的发生始于神经胚期，由前脑泡前端向外侧突出并形成视泡，随着时间推移逐渐向内侧形成视杯，眼球的雏形也逐渐形成，胚胎期10.5 d时，视杯向内凹陷，其神经母细胞迅速增殖，使视杯增厚，并逐渐发育成胚眼；胚胎期14.5 d时，视网膜分化出色素上皮层以及一部分神经母细胞层，二者无明显的分界线，直至出生后，神经母细胞层增厚，至睁眼后视网膜分层基本完成。出生后21 d时，视网膜10层结构清晰可见，此后视网膜的形态结构变化不明显，分层、视觉或感光功能均趋向成熟^［16］。本研究应用的Rd1小鼠视网膜视杆细胞磷酸二酯酶PDE6bβ亚基的7号外显子发生突变^［6］，导致细胞内cGMP累积，从而在出生后几周内引起大量视杆细胞死亡。因此，Rd1小鼠是一种理想的RP动物模型。
        在Rd1小鼠视网膜退变的中期，视网膜的各类节细胞光反应强度及光敏感度均显著低于正常小鼠，在Rd1小鼠出生后17 d左右，仅2%左右的视杆细胞保存下来，此时至少还有75%的视锥细胞也保留下来；大部分视锥细胞至第36天才逐渐消失^［5］。因此，到视网膜凋亡中期第20天时，尚存的视锥细胞和少量视杆细胞，也许可以维持整个视觉通路功能^［15］。
        PCNA是一种抗原，它的含量因细胞周期而异，主要表达于G1期至S期的增殖细胞中^［17］，是真核细胞DNA合成的一种必要核蛋白，因此常把它作为细胞增殖活性的一个指标^［18］。PCNA表达升高表明DNA合成增强，但并不意味着细胞的有丝分裂，也可能是形成多倍体或者对细胞核进行修复。
        本研究免疫组织化学染色结果显示，PCNA蛋白表达仅局限于视网膜神经节细胞，免疫阳性信号出现在第14天和第21天，而在第28天未检测到。说明随着发育时间的增加，增殖细胞减少，这与视网膜细胞发育阶段相一致。因此，证实PCNA蛋白为DNA复制必需因子，在DNA合成过程中，可能发挥重要作用。本研究实时荧光定量PCR结果显示，Rd1小鼠视网膜退化过程中，PCNA mRNA在第21天出现高表达，这与Rd1小鼠第21天PCNA蛋白的表达结果是相吻合的，提示这一时期视网膜明显增殖。