《眼科新进展》  2018年12期 1123-1128   出版日期：2018-12-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

---

注射用盐酸多西环素对兔角膜新生血管的抑制作用


        角膜碱烧伤是临床上常见的眼外伤类型，致盲率极高。碱烧伤早期细胞凋亡及炎症反应激活是造成角膜发生损伤的重要因素，碱烧伤后期角膜新生血管（corneal neovascularization，CNV）是影响角膜透明度及视力水平的重要因素^［1-2］。近年来研究表明基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）对CNV的形成有重要作用^［3］。MMPs是一族Zn²⁺依赖性内源性蛋白水解酶，以水解细胞外基质（extracellular matrix，ECM）为主要功能。CNV的生成不仅需要降解血管基底膜，而且需要ECM的降解，从而有利于血管内皮细胞的移行和增殖。目前，对MMPs活性表达的干扰已成为治疗CNV的新靶点。既往研究显示：四环素类抗生素不仅具有强大的抗炎作用，还能够通过竞争性结合MMPs活性中心的Zn²⁺来抑制MMPs降解ECM^［4］。盐酸多西环素是目前临床可应用的毒性较低而活性最强的MMPs抑制剂之一。多西环素抑制角膜碱烧伤后CNV形成的作用已经受到肯定^［5］，本研究采用碱烧伤法诱导CNV模型，观察盐酸多西环素局部应用对CNV生长的影响，并对角膜组织中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）、组织型金属蛋白酶抑制剂-2（tissue inhibitors of metalloproteinase-2，TIMP-2）的表达进行免疫组织化学检测，以进一步探讨VEGF、MMP-2、TIMP-2和CNV的关系。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　健康成年大耳白兔33只，体质量2.0～2.5 kg。雌雄不限，由西安市雁翔兔场提供。实验前裂隙灯显微镜检查双眼无疾患。在动物饲养及实验过程中，严格遵守实验动物有关规定，随机选取3只（6眼）作为对照组，其余30只（60眼）双眼行角膜碱烧伤后，右眼为多西环素组（角膜碱烧伤+多西环素治疗），左眼为碱烧伤组（角膜碱烧伤）。
1.1.2　实验试剂与药物　5 g·L^-1盐酸丙美卡因滴眼液购自美国爱尔康北京分公司，NaOH购自上海化学试剂厂，抗兔MMP-2多克隆抗体浓缩型、抗兔TIMP-2多克隆抗体浓缩型、抗兔VEGF多克隆抗体浓缩型、即用型SABC试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司，注射用盐酸多西环素（每支艾瑞得安0.1 g）由广东卫伦生物制药有限公司提供。
1.2　方法
1.2.1　碱烧伤法诱导兔CNV模型及给药　5 g·L^-1盐酸丙美卡因眼液滴眼局部麻醉，直径6 mm单层滤纸片浸泡在1 mol·L^-1 NaOH溶液中，达饱和状态，置于角膜中央1 min，40 mL生理盐水充分冲洗角膜及结膜囊2 min，术毕双眼滴氯霉素滴眼液预防感染，回笼后正常环境饲养。自碱烧伤当日起至术后3周止，多西环素组兔隔日每眼球结膜下注射0.1 mL 10 g·L^-1盐酸多西环素。碱烧伤组兔不予处理。
1.2.2　CNV生长情况观察　造模后24 h起，第1周连续每天，第2、3周隔日用裂隙灯显微观察CNV生长情况。CNV出现后，第1周连续每天，第2、3周隔日用游标卡尺测量自角膜缘生长出的CNV长度，并用数码相机拍照记录。每次测量时以连续弯曲度最小，朝向角膜中央生长的最长血管的垂直长度为准，并按照Rodert电脑数字公式S=C/12×3.14×［r²-（r-l）²］^［6］计算CNV面积。其中C为CNV累计角膜的圆周钟点数，r为角膜半径（兔角膜平均半径为7 mm），l为CNV从角膜缘长入角膜的长度。
1.2.3　免疫组织化学法检测角膜组织中VEGF、MMP-2、TIMP-2的表达　分别于烧伤后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d每组随机选取6只动物，将5 mL空气注入兔耳缘静脉内处死动物，迅速摘除带1 mm宽巩膜的角膜组织，用体积分数为10%甲醛固定24～48 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，5 μm连续切片。光镜下观察免疫组化染色切片，实验结果判定：VEGF、MMP-2、TIMP-2在细胞浆内表达，阳性反应均呈棕黄色或黄色颗粒，显微镜下观察并照相。采用OLYMPUS-BH-2摄像显微镜及Motic Med6.0数码医学图像分析系统，每张切片随机选取10个高倍视野（×400），取平均值作为该切片指标表达的平均灰度值。判定方法：灰度值越小，阳性染色越强，表明免疫反应越强，对应的指标的表达量就越高。
1.3　统计学处理　数据资料采用SPSS 16.0统计学软件数据包处理，所用计量资料先进行正态性和方差齐性检验，满足正态性和方差齐性后，用两独立样本t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　CNV生长情况观察　碱烧伤组：造模后3 d，可见CNV长入透明角膜，6～14 d CNV的生长最为旺盛，14～21 d CNV的生长速度减慢，部分CNV退化，角膜透明度较前增加。造模后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d，碱烧伤组CNV面积分别为（0.00±0.00）mm²、（17.00±4.60）mm²、（37.93±6.91）mm²、（42.25±9.32）mm²、（38.81±4.87）mm²。多西环素组：CNV的生长趋势和碱烧伤组相似，造模后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d，多西环素组CNV面积分别为（0.00±0.00）mm²、（6.15±2.85）mm²、（14.39±4.04）mm²、（18.07±5.74）mm²、（19.44±6.95）mm²，多西环素组CNV面积均明显小于碱烧伤组，两组比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。见图1。
2.2　免疫组织化学法检测角膜组织中VEGF的表达　VEGF在正常兔角膜组织中存在弱阳性表达，主要位于角膜上皮层、角膜内皮层，以上皮层为主。造模后随着时间的推移，角膜组织中VEGF的表达逐渐增强，以角膜上皮层、浅基质层、浸润的炎症细胞、CNV内皮细胞胞浆中表达明显，以造模后14 d表达最强。造模后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d，多西环素组角膜上皮层VEGF灰度值分别为167.74±10.59、140.14±12.14、128.69±9.21、103.06±8.29、176.16±9.72；碱烧伤组角膜上皮层VEGF灰度值分别为129.79±10.97、100.51±21.73、81.38±9.98、62.54±10.30、148.81±8.65；对照组角膜上皮层VEGF灰度值为170.58±5.26，造模后各个时间点角膜上皮层VEGF的表达多西环素组均明显低于碱烧伤组，两组比较差异均有统计学意义（均为 P<0.05）；造模后4 d、7 d、14 d、21 d角膜上皮层VEGF的表达多西环素组均明显高于对照组，两组比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）；造模后 1 d、4 d、7 d、14 d角膜上皮层VEGF的表达碱烧伤组均明显高于对照组，两组比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。见图2。




2.3　免疫组织化学法检测角膜组织中MMP-2、TIMP-2的表达　MMP-2和TIMP-2在正常角膜组织中表达的部位有一定的相似性，在正常兔角膜上皮细胞免疫组织化学染色阳性，以基底细胞染色最深，基质层及内皮细胞层无阳性染色，造模后4 d，角膜上皮层MMP-2的表达最强。造模后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d，多西环素组角膜上皮层MMP-2灰度值分别为99.33±17.22、83.50±14.81、123.42±16.20、110.90±8.98、161.56±53.53；碱烧伤组角膜上皮层MMP-2灰度值为75.95±16.89、65.27±12.84、91.31±13.22、94.28±6.46、117.61±13.77；对照组角膜上皮层MMP-2灰度值为123.13±6.99。造模后4 d、7 d、14 d角膜上皮层MMP-2的表达多西环素组均明显低于碱烧伤组，两组比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）；造模后1 d、4 d、14 d角膜上皮层MMP-2的表达多西环素组均明显高于对照组，两组比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）；造模后1 d、4 d、7 d、14 d角膜上皮层MMP-2的表达碱烧伤组均明显高于对照组，两组比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。见图3。
        


造模后21 d，角膜上皮层TIMP-2的表达最强。造模后1 d、4 d、7 d、14 d、21 d，多西环素组角膜上皮层TIMP-2灰度值分别为124.47±8.13、110.90±6.80、123.42±16.20、98.85±11.66、77.30±9.57；碱烧伤组角膜上皮层TIMP-2灰度值分别为127.38±9.98、142.82±2.21、128.31±10.93、100.48±15.07、187.89±8.67；对照组角膜上皮层TIMP-2灰度值为134.67±7.51。造模后各个时间点角膜上皮层TIMP-2的表达多西环素组与碱烧伤组比较差异均无统计学意义（均为P>0.05）；造模后7 d、14 d、21 d角膜上皮层TIMP-2的表达多西环素组均明显高于对照组，两组比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）；造模后14 d、21 d角膜上皮层TIMP-2的表达碱烧伤组均明显高于对照组，两组比较差异均有统计学意义（均为P<0.05）。见图4。



3　讨论
        目前的研究表明，CNV形成是一个复杂的病理过程，受到多种因素的调节，许多细胞因子所形成的生长因子网络精确地调控着CNV的形成。VEGF是目前发现最强的促血管形成因子，VEGF的过度表达与CNV的发生发展密切相关。本研究结果显示：造模后4 d，CNV处于增殖期，VEGF表达量显著增加，角膜基质层，尤其是毗邻于烧灼区的浅基质层聚集着大量高度表达VEGF的炎症细胞，表明VEGF的表达与炎症细胞关系密切。Edelman等^［7］在相同的动物模型中证实化学碱烧伤后角膜VEGF的主要来源是从角膜缘侵入角膜基质层的白细胞。本实验中也观察到同样结果，角膜上皮细胞也表达VEGF，造模后7~14 d，角膜上皮细胞层、基质层细胞、炎症细胞、CNV内皮细胞VEGF的表达逐渐增强，这与宏观观察到的CNV的生长情况一致。当造模后21 d，角膜中VEGF表达量显著下降，对应于血管退行期CNV生长停滞、血管密度降低。由此进一步证实了VEGF是有效的内源性角膜血管生长因子，VEGF在角膜造模后CNV形成中起着关键作用。
        MMPs和TIMPs之间的动态平衡是保持ECM完整性的前提条件。唐维强等^［8］在缝线诱导大鼠CNV模型中运用明胶酶谱法检测MMP-2的活性得出，MMP-2在正常角膜主要以酶原形式存在，在CNV角膜的含量和活性明显高于正常角膜。Kvanta等^［9］用氪激光光凝器诱导鼠角膜产生CNV，并检测出MMP-2 mRNA表达增加，其增加在某种程度上局限于浸润的炎症细胞（主要是中性粒细胞），这表明炎症细胞诱导产生的MMP-2可通过降解血管基底膜和ECM而参与CNV的形成。本实验发现，在正常角膜上皮细胞胞浆内即有MMP-2、TIMP-2的阳性表达，提示MMP-2、TIMP-2在维持角膜的正常生理状态中发挥着一定的作用，这与Imanishi等^［10］的研究结果一致。MMP-2活性升高主要发生于造模后1~4 d，即CNV形成期，其表达明显高于对照组（P<0.05）；其组织型抑制剂TIMP-2的表达与MMP-2不同步，早期变化不明显，造模后7 d开始升高，21 d达最高；可见7 d以前MMP-2的活性尚未受到TIMP-2干预，因而能持续地降解基底膜胶原，促进内皮细胞迁移和增殖，形成CNV；MMP-2的表达局限于浸润的炎症细胞周围，表明炎症细胞诱导产生的MMP-2可降解血管基底膜而参与CNV的形成，这与吴娟等^［11］的研究结果一致。造模后21 d，TIMP-2的高表达可抑制MMP-2的活性，促进CNV的退化。
        1983年Golub等^［12］首次此报道四环素类药物具有抑制MMPs降解胶原的功效，多西环素的MMPs抑制活性与其抗生素活性无关，而是通过以下几种机制实现的：（1）限制中性粒细胞胶原酶和上皮细胞明胶酶的基因表达，从而减少MMPs的合成^［13］；（2）抑制α1-抗胰蛋白酶的降解，利于α1-抗胰蛋白酶发挥抑制MMPs的作用^［15］；（3）螯合二价金属离子（如Zn²⁺、Ca²⁺），从而抑制MMPs（如胶原酶，明胶酶等）的功能发挥^［14］；（4）清除活性氧（reactive oxygen species，ROS）。多西环素是具有抗炎及诱导凋亡作用的药物^［15］，用于肿瘤的治疗能够影响细胞凋亡、抑制血管新生。多西环素的副作用与毒性在四环素类药物中最低，但结合Zn²⁺能力最强，是目前临床可应用的活性最强的MMPs抑制剂。我们的研究发现角膜造模后，碱烧伤组较多西环素组角膜基质内炎症细胞浸润重，角膜基质的降解更严重，角膜溃疡的发生率更高，溃疡较深而难以愈合，CNV生长旺盛，推测可能与盐酸多西环素抑制MMPs的活性、抑制角膜基质的降解、抑制角膜溃疡的形成作用有关。
        综合我们的研究结果分析，角膜碱烧伤造模后MMP-2在角膜上皮细胞和浸润的炎症细胞中大量表达，在炎症反应强烈时MMP-2表达增强，提示MMP-2与炎症细胞的浸润密切相关；但采用结膜下注射盐酸多西环素时，角膜组织中的炎症细胞浸润和MMP-2的表达明显减弱，而TIMP-2的表达无明显增强，同时CNV的生长速度减慢，并且较早就开始退化。由此提示，盐酸多西环素抑制CNV生长的作用机制可能与抑制MMP-2的活性有关。推测盐酸多西环素一方面可能通过抑制MMP-2的活性，从而抑制角膜组织的破坏和炎症细胞的浸润，减少炎症介质和促血管形成因子的释放；另一方面盐酸多西环素可能通过抑制角膜基质的降解，抑制角膜组织的破坏和炎症细胞的浸润，从而抑制VEGF的表达，进一步抑制MMP-2的活性，达到抑制CNV生长的目的。这与袁静等^［16］的研究结果相似。因此我们认为，VEGF和MMP-2、TIMP-2在碱烧伤造模后CNV发生的调控中发挥着重要的作用，VEGF既可直接促进CNV的生成，又能通过与MMP-2的表达相互调节间接促进CNV的形成，TIMP-2通过抑制MMP-2的活性而抑制CNV的形成。
        在本实验中，尽管盐酸多西环素在一定程度上抑制了CNV的生长，但其未能彻底阻断CNV的生长，持续的炎症因子可以导致CNV的继续生长。因此，我们推测，盐酸多西环素只是抑制促血管形成过程中的某些环节，如抑制角膜基质的降解，抑制MMP-2的活性。在CNV的形成机制中，存在着多种细胞因子和蛋白酶的网络调控机制，即有多种因素同时发挥作用，因此联合应用多种不同作用机制的抗CNV药物可能提高抗血管生成的效果，值得进一步深入地探讨。