《眼科新进展》  2018年12期 1119-1122   出版日期：2018-12-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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钠尿肽受体A（NPR-A）在小鼠角膜和晶状体发育过程中的表达


        钠尿肽受体A（natriuretic peptide receptor A，NPR-A）是钠尿肽受体家族中的重要一员，其本身也是鸟苷酸环化酶耦联受体，主要通过与心钠肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和脑钠肽（brain natriuretic peptide，BNP）结合，升高细胞内cGMP水平来介导钠尿肽的生理学效应^［1］。以往对于钠尿肽及其受体的研究主要集中在心血管系统及其利钠、利尿、舒张血管等生理功能上^［2］，故钠尿肽及其受体与高血压和肾病关系的研究颇多。之后在中枢神经系统和眼房水中也发现ANP和NPR-A的表达，且对神经发育和眼压等起着重要的调节作用^［3-5］。角膜和晶状体作为眼屈光系统的重要组成部分，最近也有报道在成人角膜上皮细胞和晶状体上皮细胞中发现了钠尿肽受体的存在^［6-8］，但其具体的细胞定位和作用机制仍不清楚，而且在晶状体和角膜发育方面的研究国内外未见报道。成熟角膜结构分为五层，由前向后依次为上皮细胞层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮细胞层；其发育规律先是由表皮外胚层细胞分化成原始角膜上皮，接着神经脊细胞来源的间叶细胞迁移，进而分化成角膜内皮细胞和基质成纤维细胞^［9］。晶状体也同样来源于表皮外胚层，先是晶状体板的形成，然后内陷成晶状体泡，晶状体泡前壁细胞形成晶状体上皮，呈单层立方或低柱状上皮。而后壁细胞逐渐延长，细胞核丢失，最后形成了充满于晶状体腔的类似同心圆排列的晶状体初级纤维。本研究利用免疫组织化学方法检测NPR-A在角膜和晶状体发育过程中的表达，旨在探讨其在角膜和晶状体的发育及维持晶状体透明性和角膜修复中的重要生理学意义。
1　材料与方法
1.1　实验动物　实验动物选用C57BL/6小鼠，将雌雄鼠合笼，于第2天查栓，以查到栓子之日计为E0（embryonic day 0），仔鼠出生当天计为 P0 （postnatal day 0），之后以此类推。本实验选用E14至P90小鼠，雌雄不限，选择E14、E16、E18、P0、P1、P3、P5、P7、P14、P30、P60、P90共12个时间点，每个时间点10只小鼠，共120只。
1.2　方法
1.2.1　实验标本制作　胎鼠的获取为孕鼠腹腔注射苯巴比妥钠（30 mg·kg^-1），经麻醉后直接剖腹并整体取出，置于40 g·L^-1多聚甲醛中浸泡固定24 h。出生后的仔鼠则首先经腹腔麻醉后，再用40 g·L^-1多聚甲醛灌注固定，之后取出眼球于Bouin溶液中后固定24 h，常规脱水、透明、石蜡包埋，于矢状位进行连续切片，厚度为5 μm。石蜡切片常规脱蜡入水，进行免疫组织化学染色。
1.2.2　NPR-A免疫细胞化学染色　石蜡切片常规脱蜡入水，经微波抗原修复后自然冷却至室温，以0.1 mol·L^-1 PBS冲洗5 min×3次，加一抗4 ℃过夜并室温孵育30 min，用于检测的抗体为：兔抗NPR-A多克隆抗体 （1∶50，Abcam公司，ab70848）、羊抗双皮质素（doublecortin，DCX）多克隆抗体 （1∶600，Santa Cruz 公司，sc-8066）、兔抗SOX2多克隆抗体（1∶500，Abcam 公司，ab97959），第2天取出后用0.1 mol·L^-1 PBS冲洗5 min×3次，加二抗于室温下避光孵育3 h，相应的二抗为：Alexa 488驴抗兔IgG （1∶500，Invitrogen公司，A-21202）、Alexa 594驴抗羊IgG （1∶800，Invitrogen公司，A-11058）。然后用0.1 mol·L^-1 PBS冲洗切片5 min×3次。由于DAPI （4’，6-diamidino-2-phenylindole）是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，故能较好地显示细胞核的形态。为了更好显示角膜和晶状体的组织学结构，本研究采用DAPI对角膜和晶状体的结构进行衬染。封片过程中，将DAPI （1∶1500）渗入到体积分数65%甘油中封片，最后在罗达明、FITC和紫外光激发光下用Olympus荧光显微镜（BX61，日本产）对角膜和晶状体进行观察并摄片。对照组：以PBS代替一抗作为阴性对照。
2　结果
2.1　NPR-A在角膜中的表达　NPR-A开始出现在胚胎期E16小鼠角膜上皮细胞中，并持续高表达至成年，而角膜基质层的纤维细胞和内皮细胞中NPR-A的表达随鼠龄的增长而逐渐减弱。在E16，NPR-A开始表达在角膜上皮细胞中（图1A），出生后进一步增强（图1B），P14达到高峰（图1C），之后持续高表达。另外，NPR-A也于E16在角膜基质层和内皮细胞开始表达，P5时NPR-A表达进一步增强，且广泛分布在成纤维细胞和内皮细胞中；P14时，角膜基质层和内皮层发育成熟，可见纤维细胞和内皮细胞的核扁平、狭长呈梭形，细胞间密度也减小，此时NPR-A的表达却显著减少，仅稀疏地分散在纤维细胞和内皮细胞的表面。在角膜发育早期，新生神经元标记物DCX（图1D、图1E、图1F）与NPR-A共表达于内皮细胞（图1G、图1H）和上皮细胞中（图1I），提示NPR-A与细胞增殖有关。
2.2　NPR-A在晶状体内的表达　从P0开始，NPR-A开始高表达在晶状体前囊上皮细胞膜上，随着鼠龄增加，中部上皮细胞中NPR-A表达减弱，至P90，免疫阳性细胞主要集中在赤道部附近的上皮细胞膜。此外，NPR-A也高表达于由后上皮细胞生成的初级纤维中，并随着鼠龄的增长，纤维细胞的形态不仅发生了改变，而且NPR-A的表达也逐渐减弱，直到成年后消失。在E16，NPR-A首先出现于晶状体纤维中（图2A），P0开始大量表达在初级纤维细胞上（图2B），但P7以后，NPR-A从中心向外周逐渐减少（图2C），至P90消失（图2D）。同时NPR-A阳性纤维细胞形态也发生着改变，P0时纤维细胞围绕前极呈现较大不规则的多边形（图2E），P3时周围细胞胞体增大、延长呈梭形（图2F），P7时胞体变得狭长呈丝状，并呈同心圆结构排列（图2G）。NPR-A与干细胞标记物SOX2在晶状体纤维细胞上表达非常相似（图 2H），都存在于变化中的纤维细胞上，提示NPR-A与纤维细胞的生长发育有关。




3　讨论
        钠尿肽系统在眼中的表达已有报道，并且越来越多的证据也证明了它们在眼中具有调节水盐代谢、维持细胞稳态、控制眼压、激活鸟苷酸环化酶、保护线粒体等作用。但它们是否也参与了眼的发育，却很少有相关文献报道。小鼠角膜和晶状体的胚胎发育起源于表皮外胚层，与神经组织拥有相同的发育学祖先，其胚胎诱导、发育以及出生后的成熟都需要转录因子的调节和各种相关蛋白的积累^［10］。NPR-A作为钠尿肽系统的一种主要的膜受体蛋白，在神经组织中扮演着神经发育调节因子的角色，我们推测其也可能参与了角膜和晶状体的发育。本实验利用免疫组织化学技术对不同鼠龄的小鼠角膜和晶状体进行免疫荧光检测，发现NPR-A在胚胎期和成年的小鼠角膜、晶状体内都有表达，提示其可能参与了小鼠角膜和晶状体的发育，并对维持它们良好的透明度和功能修复起着关键的作用。
        小鼠角膜发生约于E11，先由前部毗邻晶状体泡的表皮外胚层发育成角膜上皮层，之后神经嵴形成内部的单层内皮细胞，最后前部中胚叶组织形成角膜基质层穿插在两层之间，并主要由胶原纤维和成纤维细胞构成^［10］。本研究结果显示，NPR-A在胚胎期新生小鼠角膜上高表达，之后随着角膜逐渐发育完善，免疫阳性却逐渐减弱，提示NPR-A很可能参与了角膜早期细胞的生长；而且还发现NPR-A与DCX共表达，考虑到DCX是一种用来标记细胞增殖的蛋白，这就提示角膜上皮层细胞一直处于增殖较为活跃的状态，而NPR-A可能参与了角膜早期细胞的增殖和分化。所以我们推测NPR-A参与了角膜的发育。成熟角膜中也有NPR-A的存在，且主要表达在角膜上皮层，提示NPR-A可能通过调控角膜上皮细胞的增殖和修复、水盐代谢等途径来维持角膜的生理屏障功能。众所周知，角膜上皮细胞在角膜成熟后仍然处于增殖活跃的状态，且一直持续至成年，以维持角膜细胞的更新。而一旦角膜损伤后，上皮细胞便会加快增殖、迁移、重塑等过程，修复损伤并重新恢复屏障和屈光功能。结合NPR-A在神经系统具有介导细胞增殖和凋亡功能^［11］，我们推测NPR-A也参与了调控上皮细胞的增殖和损伤后的修复功能。
        晶状体的发育是一个非常有序的过程，主要包括晶状体板的内陷、分离和细胞的分化、迁移、凋亡等过程。首先视泡与表皮外胚层接触后诱导该处的表皮外胚层增厚形成晶状体板，为晶状体始基。随后晶状体板内陷入视杯内，且渐渐与表皮外胚层脱离，形成晶状体泡。晶状体泡的前壁细胞分裂并保持立方形，即为晶状体上皮细胞，后壁细胞逐渐伸长，之后脱去细胞器，最终分化成不再分裂的初级晶状体纤维，并呈同心圆排列。正是由于初级纤维独特的细胞形态和排列结构，才保证了晶状体的透明性和屈光能力^［12-14］。随着发育的成熟，前部具有分化能力的上皮细胞逐渐集中到赤道区，并终生分裂成次级晶状体纤维，逐步代替初级纤维。本研究发现，NPR-A在新生小鼠晶状体上皮细胞膜中高表达，说明其与晶状体早期发育有关，而成年后持续高表达，提示其可能参与了上皮细胞的增殖和生理代谢。众所周知，位于赤道部周边区的晶状体上皮细胞是晶状体内唯一具有终生不断分化、增生能力的细胞，且在某些基因和生长因子的作用下，它们能不断地分化为次级晶状体纤维细胞，对维持晶状体的生长发育和生理功能至关重要，其异常增殖与凋亡也被认为与某些类型的白内障相关^［15］。作为晶状体的生理代谢中心，上皮细胞还能通过增大体积及紧密排列组成晶状体囊，与外界进行物质交换，一旦晶状体囊通透性和水代谢紊乱，则均会导致细胞纤维的肿胀、断裂，导致晶状体的透明度下降，从而引发白内障^［16］。
        本研究结果还表明，从晶状体纤维的发生到形态的成熟，NPR-A在初级纤维细胞中高表达，这提示其对初级纤维细胞的生长发育具有诱导作用。然而在初级纤维细胞成熟后，其表达却逐渐减弱，直到成年后消失，这说明NPR-A可能与晶状体的透明性有关。晶状体初级纤维细胞构成了晶状体的主体，其独特的细胞形态和有序的纤维结构对维持晶状体的透明性具有重要意义。随着鼠龄的增长，初级纤维细胞逐步脱去细胞核，从而保障光线的顺利通过。当晶状体发育成熟后，初级纤维细胞的增长处于静止状态，并逐步被赤道部上皮细胞所生成的次级纤维细胞代替，继续维持晶状体的透明性^［13］。在实验中我们也发现，NPR-A在成年晶状体赤道部上皮细胞膜持续高表达，这说明在晶状体成熟后，NPR-A参与了晶状体上皮细胞向次级纤维细胞的分化过程，从而维持晶状体的透明性和屈光能力。
        总之，本实验证明了NPR-A在发育中的小鼠角膜和晶状体内均有表达，并推测了其在角膜和晶状体发育以及维持正常生理功能中的重要作用。但其中的重要机制仍需要进一步探索和证实，以便为白内障等眼科疾病的治疗提供新的理论基础。