《眼科新进展》  2018年12期 1114-1118   出版日期：2018-12-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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丹参酮ⅡA对人角膜基质细胞纤维化的抑制作用


        角膜损伤后自然修复过程中的角膜纤维化可形成角膜瘢痕，造成一定的视力损害^［1］。创伤或手术后的角膜上皮细胞会诱导伤口边缘的人角膜基质细胞（human keratocyte，HK）凋亡，伤口边缘邻近的HK由静止状态变成活跃状态，即成纤维细胞。同时，成纤维细胞可迁移至角膜受损伤的部位进行增殖，当其移行至角膜伤口边缘无细胞区会进一步转化为肌成纤维细胞，产生了角膜瘢痕^［2-4］。角膜瘢痕形成过程中常伴有角膜混浊的现象，主要原因是由于HK纤维化后会过度分泌相关的基质成分，如纤连蛋白 （fibronectin，FN）、I型胶原 （collgen I，COL I），从而导致细胞外的基质成分排列紊乱，最终引起角膜混浊^［5-7］。因此，在角膜创伤愈合过程中降低角膜瘢痕的形成对保护视力有非常重要的临床意义，然而目前临床上对抑制角膜瘢痕形成仍缺乏有效的手段。已有研究显示，丹参酮ⅡA （tanshinoneⅡA，TSN）对抑制心、肝、肺、肾的纤维化具有很好的效果^［8-12］，但TSN是否对角膜瘢痕形成有类似的抑制作用尚不清楚。本研究通过转化生长因子β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1）体外诱导的方法构建角膜纤维化模型，并予以TSN处理，以期初步确认TSN是否有防治角膜瘢痕的潜力。
1　材料与方法
1.1　材料　HK从正常人角膜取材，筛选得到的P0或P1细胞（Sciencell，货号：6520）。TSN （Sigma，批号：SLBD4342V）；重组人TGF-β1 （PEPROTECH，批号：qtsj00153）；2.5 g·L^-1胰蛋白酶（Gibico，批号：1782823）；DMEM培养基（Gibico，批号：8117088）；胎牛血清（Gibico，批号：1828728）；CCK-8（碧云天公司，批号：ks607）；Trizol试剂（Invitrogen，批号：119703）；qPCR试剂盒（TaKaRa，批号：AHG0334A）；PCR引物（华大基因公司合成）。细胞培养箱（Thermo）；相差显微镜（奥特光学）；酶标仪（BIOTEK）；超净工作台（AIRTECH）；PCR仪（BIO-RAD）；Western blot系统（BIO-RAD）等。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养与刺激处理　在无菌操作条件下培养原代HK并传代至4-7代，饥饿同步化处理细胞24 h后进行分组实验。空白对照组：更换正常新鲜培养基继续培养24 h；TGF-β1诱导组：分别更换含 2.5 μg·L^-1、5.0 μg·L^-1TGF-β1的新鲜培养基继续培养24 h；TSN抑制组：更换含1.0 μmol·L^-1、2.5 μmol·L^-1、5.0 μmol·L^-1 TSN的新鲜培养基预处理2 h后，再更换分别含1.0 μmol·L^-1、2.5 μmol·L^-1、5.0 μmol·L^-1 TSN和5.0 μg·L^-1 TGF-β1的新鲜培养基培养24 h。
1.2.2　Western blot检测细胞α-平滑肌肌动蛋白、Vimentin蛋白表达　通过RIPA裂解液处理提取HK总蛋白质，经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭后，加入相应一抗［鼠源α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA） 1∶1000、兔源Vimentin 1∶1000、鼠源GAPDH 1∶1000］ 4 ℃孵育过夜，再加入相应二抗（鼠源α-SMA 1∶10 000、兔源Vimentin 1∶10 000）室温孵育2 h。相应条带经过免疫印迹化学发光试剂显色，显影、拍照后进行吸光度值（A值）的分析，以GAPDH为参照进行统计分析。
1.2.3　qPCR检测FN、COLⅠ mRNA表达水平　通过Trizol法提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒操作说明将RNA逆转录为cDNA，进行PCR扩增。FN上游引物：5’-AGGAAGCCGAGGTTTTAAACTG-3’，下游引物：5’-AGGACGCTCATAAGTGTCACC-3’，扩增片段长度105 bp。COL Ⅰ上游引物：5’-GAGCGGTAACAAGGGTGAGC-3’，下游引物：5’-CTTCCCCATTAGGGCCTCTC-3’，扩增片段长度91 bp；GAPDH上游引物：5’-TGGGTGGAATCATATTGGAACAT-3’，下游引物：5’-CGGAGTAACGGATTTGGTC-3’，扩增片段长度87 bp。以GAPDH mRNA转录水平为参照进行统计分析。
1.2.4　细胞免疫荧光染色　将HK种于含有爬片的24孔培养板中，饥饿同步化处理后分别更换正常新鲜培养基（空白对照组）和前述中含不同药物的新鲜培养基进行培养（TGF-β1诱导组、TSN抑制组）培养24 h。各处理组经过多聚甲醛固定、Triton通透、BSA封闭等处理后，在4 ℃冰箱中进行相应一抗的孵育（鼠源α-SMA 1∶400；兔源Vimentin 1∶400）过夜，第2天室温下避光进行相应的二抗孵育（鼠源α-SMA 1∶1000；兔源Vimentin 1∶1000）。用含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片处理后用共聚焦荧光显微镜进行拍照及分析。
1.2.5　TSN对TGF-β1诱导的HK增殖的影响　将第3代对数生长期的HK消化吹打成单细胞悬液，调整细胞浓度为500×10⁶个·L^-1，每孔200 μL接种于3块96孔培养板中，待密度达60%~70%进行饥饿同步化处理后，分别更换正常新鲜培养基（空白对照组）和含不同浓度TSN（0.362 5 μmol·L^-1、0.625 μmol·L^-1、1.25 μmol·L^-1、2.5 μmol·L^-1、5.0 μmol·L^-1、10.0 μmol·L^-1、20.0 μmol·L^-1、30.0 μmol·L^-1）新鲜培养基进行培养12 h、24 h、36 h，通过CCK-8试剂盒进行处理后利用酶标仪检测450 nm波长处的A值以对细胞的增殖活性进行分析，以找到合适的药物浓度和作用时间来进行相关实验。
1.3　统计学方法　采用SPSS 18.0统计分析软件。实验数据采用均值±标准差表示，组间比较采用t检验或卡方检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　TGF-β1对HK纤维化的诱导作用　HK纤维化标志蛋白质的α-SMA及细胞骨架蛋白质Vimentin均随着TGF-β1诱导浓度的增加其蛋白表达水平也随之增高（图1）。同时，HK中FN、COL Ⅰ mRNA表达水平也随之增高（表1）。以上结果表明，TGF-β1在一定浓度范围内诱导HK纤维化存在量效关系。




加入诱导剂后，HK细胞形态也发生了纤维化的改变。通过对HK中Vimentin的免疫荧光染色发现，5.0 μg·L^-1 TGF-β1诱导的HK形态与空白对照组（图2A）相比，细胞极性发生了明显的变化，出现了纤维化的形态特征。TGF-β1诱导的HK由星形或三角形变成更加扁平的长梭形（图2B）。



2.2　TSN的细胞毒性实验　不同浓度的TSN及不同培养时间等条件下对HK的毒性作用结果见图3。在相同的培养时间下，TSN一定浓度范围内HK的活性不受影响，而随着TSN浓度的增高，HK的活性显著下降。其中在培养12 h和24 h条件下，不影响细胞活性的TSN阈值浓度为5.0 μmol·L^-1，显著大于培养36 h条件下的TSN阈值浓度0.625 μmol·L^-1。综合考虑，为了保证TSN与HK充分接触的时间而又不影响细胞活性，我们选择的研究条件为TSN给药浓度不大于5.0 μmol·L^-1和培养24 h。



2.3　TSN对TGF-β1诱导的HK纤维化的作用　基于上述建立的HK纤维化模型和TSN的给药条件，通过TGF-β1和TSN联合给药的方式来研究TSN对TGF-β1诱导的HK纤维化的抑制效果见图4，结果表明，随着TSN浓度的增高（0 μmol·L^-1、1.0 μmol·L^-1、2.5 μmol·L^-1、5.0 μmol·L^-1），纤维化标志蛋白α-SMA蛋白表达量逐渐下调。表2结果同样表明了HK中FN、COL Ⅰ mRNA基因转录水平也随之下降。形态学观察TSN对TGF-β1诱导的HK的抑制效果如图5所示，通过对α-SMA和Vimentin的免疫荧光染色发现，TGF-β1诱导的HK由星形或三角形变成更加扁平的长梭形。5.0 μg·L^-1 TGF-β1诱导的HK形态与空白对照组相比，细胞极性发生了明显的变化，出现了纤维化的形态特征，即TGF-β1诱导的HK由星形或三角形变成更加扁平的长梭形。TSN抑制组（5.0 μmol·L^-1 TSN+5.0 μg·L^-1 TGF-β1）与TGF-β1诱导组（5.0 μg·L^-1 TGF-β1）相比，其细胞极性的改变减少即纤维化程度有所降低。则提示TSN能够一定程度上抑制TGF-β1诱导的HK的纤维化程度。综上所述，TGF-β1在一定浓度范围内诱导HK纤维化存在量效关系。而TSN对TGF-β1诱导的HK纤维化有显著抑制作用，并且这种抑制也存在一定的量效关系。





3　讨论
        角膜损伤引起的角膜瘢痕是全球三大致盲疾病之一，对角膜瘢痕的防治在临床上意义重大，然而目前对角膜瘢痕形成的预防尚缺乏有效手段。本研究利用培养的HK初步探究TSN是否具有防治角膜瘢痕的作用。本研究结果显示，TSN可抑制TGF-β1诱导的HK的纤维化，具有抗角膜瘢痕的潜力。
        正常角膜组织中，HK处于相对静止状态，当角膜上皮细胞受到外界刺激或损伤时，其边缘的HK会由静止状态变为活跃状态，从而转化为成纤维细胞，并向损伤部位迁移^［13］。有证据表明这一过程的发生与组织中TGF-β1表达上调相关^［14-18］。TGF-β1是一个多效能因子，可促进心、肝、肾、肺等器官的纤维化^［19-21］。TGF-β1在角膜损伤修复的早期表现最为活跃，可激活HK，参与细胞迁移的损伤修复阶段，并促进肌成纤维细胞的分化与增殖^［22］。利用这一特点，我们在培养的HK中加入不同浓度TGF-β1，结果显示，5.0 μg·L^-1TGF-β1能高效地诱导HK纤维化，这与现有的研究结果一致^［23］。TGF-β1诱导HK纤维化模型的建立也为我们进一步评估TSN对角膜瘢痕形成的抑制效果提供了有效的途径。
        现有的研究显示，TSN对心、肝、肺、肾纤维化都有抑制作用^［8-12］。但其在HK纤维化过程中是否具有相似作用并不清楚。借助TGF-β1诱导HK纤维化的模型，通过TGF-β1和TSN联合给药，本实验结果显示，TSN能降低角膜相关纤维化因子的表达水平，同时细胞形态学的比较也发现HK纤维化程度显著降低。这些结果提示TSN对HK纤维化也具有有效的抑制作用，这为临床上预防角膜瘢痕的形成提供了新思路。
        目前已证实TSN对多种脏器纤维化有治疗或缓解作用，且对抗纤维化通路进行了相关研究，但具体机制仍未完全明确。其中，TGF-β1信号通路受Smad蛋白质家族调控在其他组织器官已得到充分研究，如Zhao等^［24］研究肺纤维化过程中Smad2和Smad3在博来霉素致肺纤维化动物模型体内的表达发现，在诱导分化的过程中Smad3在肺内表达受到调控。那么，在接下来的实验中，也可以尝试这条通路蛋白质的相关研究。