《眼科新进展》  2018年12期 1105-1108   出版日期：2018-12-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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Arresten在氧诱导小鼠视网膜新生血管形成中的抑制作用及机制


        视网膜组织缺血缺氧诱发的视网膜新生血管（retinal neovascularization，RNV）形成是导致视功能损害的重要原因之一^［1］。已有大量研究证实，血管生成诱导因子和血管生成抑制因子在RNV形成过程中均发挥重要作用，两者的平衡状态决定了新生血管是否出现^［2］。Arresten是一种特异性抑制内皮细胞增殖和血管生成的多肽因子，研究表明Arresten蛋白对肿瘤新生血管形成有抑制作用^［3］。然而，它对RNV形成的作用及机制仍不清楚。本研究拟利用氧诱导视网膜病变（oxygen induced retinopathy，OIR）小鼠模型，通过在小鼠玻璃体内注射Arresten蛋白，探讨Arresten对RNV形成的作用及可能机制。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物及分组　选取48只出生后7 d健康清洁级C57BL/6J幼鼠 （购自南昌大学医学院实验动物中心），按随机数字表法将幼鼠分为3组，每组16只，分别为OIR+Arresten组、OIR组和常氧组。实验动物的使用严格遵循南昌大学及视觉与眼科研究协会关于科学研究中动物使用的相关规定。
1.1.2　主要试剂及仪器　相对分子质量约为20×10³的异硫氰酸葡聚糖（FITC-dextran）（美国Sigma公司）；抗淬灭封片剂（美国Vectashield公司）；CY-12C数字测氧仪（浙江省建德市梅城电化分析仪器厂）；荧光显微镜（日本Olympus公司）；Hamilton微量注射器（上海骊葆科学仪器有限公司）；DG5033A酶联免疫检测仪（上海珂淮仪器有限公司）。
1.2　方法
1.2.1　OIR小鼠模型的建立　根据文献^［4］提供的方法：将OIR+Arresten组及OIR组幼鼠饲养在密闭玻璃容器中，持续通入体积分数为（75±2）％的氧气，CY-12C数字测氧仪每4 h测量1次出气口处的氧气体积分数，每天开放密闭容器1次，更换鼠粮、垫料、水及轮换母鼠。当幼鼠在高氧环境中连续饲养5 d后再转移至普通空气环境中饲养5 d。常氧组幼鼠则在普通空气环境中连续饲养10 d。
1.2.2　玻璃体内注射Arresten蛋白　OIR+Arresten组幼鼠在高氧环境下饲养结束时，经腹腔内注射10 g·L^-1戊巴比妥钠全身麻醉后，在位于角膜缘后2 mm处用10 μL微量注射器以45°进针，缓慢将2 μL 10 mg·L^-1的Arresten蛋白注入幼鼠的双眼玻璃体内。注射完毕，静置15 s后缓慢撤针。OIR组和常氧组幼鼠用同样方法注射等量生理盐水于玻璃体内。
1.2.3　小鼠荧光素眼底血管造影　按照文献^［5］描述的方法，首先将FITC-dextran粉末溶于去离子水中，配制成50×10³ mg·L^-1的FITC-dextran溶液。各组分别取6只出生后第17天的小鼠，腹腔内注射戊巴比妥钠全身麻醉后，显微镜下用1 mL注射器经股静脉缓慢注入0.5 mL FITC-dextran溶液，静置10 s后缓慢撤针，待FITC-dextran循环5 min后利用二氧化碳窒息法处死幼鼠，迅速摘出眼球，放置于40 g·L^-1 多聚甲醛溶液中固定40 min。显微镜下小心分离出视网膜，然后以视盘为中心放射状将视网膜剪成4瓣，用含DAPI的抗淬灭封片剂封片，于暗室内在荧光显微镜下观察并照相。并用CellSens Standard软件（日本Olympus公司）测量视网膜无灌注区及荧光渗漏区的相对面积。
1.2.4　小鼠眼球玻璃体内新生血管内皮细胞核计数　在小鼠出生后第17天，各组分别取6只小鼠，处死后摘除眼球，石蜡包埋，沿矢状位切成厚度为4 μm的石蜡切片，每间隔10张收集1张用于计数新生血管细胞核数量，每只眼球共收集10张切片，排除含视神经的切片，行苏木精-伊红染色，分别计算出每张切片中突破内界膜进入玻璃体内的新生血管内皮细胞核的数量，然后计算出每张切片的平均数。
1.2.5　MTT法检测Arresten蛋白对人血管内皮细胞增殖的影响　收集处于对数生长期的人脐静脉内皮细胞，于96孔培养皿中按20×10⁶个·L^-1细胞密度进行接种，每孔100 μL。培养至细胞单层铺满孔底，分成实验组及对照组，每组设7个复孔。实验组培养液中分别加入浓度为200 μg·L^-1、400 μg·L^-1、600 μg·L^-1、800 μg·L^-1、1000 μg·L^-1、1200 μg·L^-1、1400 μg·L^-1的Arresten蛋白溶液，对照组培养液加入等体积PBS溶液。培养3 d后，弃培养液，PBS清洗2遍，加入5 g·L^-1MTT培养液20 μL，孵育4 h。每孔加入100 μL Formanzan溶解液，充分溶解后用酶联免疫检测仪测量波长570 nm 处各孔的吸光度（A）值，然后计算细胞的增殖抑制率。增殖抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%，然后以细胞的增殖抑制率为纵轴，Arresten蛋白浓度（μg·L^-1）为横轴，绘制细胞增殖抑制曲线。
1.3　统计学方法　采用SPSS 17.0统计学软件进行统计分析。各组量化的数据资料经Shapiro-Wilk检验呈正态分布，经Levene检验证实方差齐，以x?±s表示。各组视网膜无灌注区相对面积及突入玻璃体内的新生血管内皮细胞核数量的总体比较均采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　各组小鼠FITC-dextran眼底血管造影时视网膜无灌注区及荧光渗漏区的相对面积　常氧组小鼠的视网膜血管呈均匀网状结构分布，视网膜中央未发现无灌注及荧光渗漏区（图1A）；OIR组视网膜中央可见大片无灌注区及荧光渗漏区，荧光渗漏区主要位于无灌注区和灌注区的交界处 （图1B）。OIR+Arresten组视网膜中央可见小面积无灌注区（图1C）。定量分析其面积：常氧组、OIR组、OIR+ Arresten组视网膜无灌注区相对面积分别为（2.35±1.62）％、（57.28±9.36）％和（20.38±8.69）％，三组间视网膜无灌注区相对面积总体比较，差异有统计学意义（F=18.732，P<0.05）；且OIR组无灌注区相对面积显著高于OIR+Arresten组，差异有统计学意义（P<0.05）。



2.2　各组小鼠视网膜形态及侵入玻璃体内的血管内皮细胞核数量比较　将视网膜石蜡切片进行苏木精-伊红染色，结果显示，OIR组内界膜形态极不规则，细胞排列紊乱、增生明显，可见大量侵入玻璃体内的新生血管管腔，每张切片上血管内皮细胞核的数量为（15.18±4.83）个。OIR+Arresten组也可发现有新生血管侵入玻璃体内，每张切片上血管内皮细胞核的数量为（7.33±3.88）个。而常氧组小鼠视网膜的内界膜结构仍保持平滑完整，未发现有新生血管侵入玻璃体内。3组间侵入玻璃体内的新生血管内皮细胞核数量总体比较，差异有统计学意义（F=106.37，P<0.05）；其中，OIR+Arresten组侵入玻璃体内的新生血管内皮细胞核数量显著低于OIR组，差异有统计学意义（P<0.001）。见图2。



2.3　Arresten蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用　Arresten蛋白对人脐静脉内皮细胞的增殖有明显的抑制作用，且当Arresten蛋白浓度在1000 μg·L^-1以下时，抑制率随着浓度的增加而上升，当Arresten蛋白浓度为1000 μg·L^-1时，人脐静脉内皮细胞的增殖抑制率达到顶峰，为（58.00±0.65）％；随后继续增加Arresten蛋白浓度，细胞增殖抑制率并不增加。见图3。



3　讨论
        RNV形成是致盲的重要原因之一，由于新生血管通透性高、易引起出血，并且可以促进结缔组织增生形成对视网膜的牵拉，从而引起患者视力下降。尽管抗血管内皮生长因子药物治疗是目前治疗RNV的有效方法，但它仍然存在很多不足^［6-8］，如临床上经常会发现有相当一部分患者对抗血管内皮生长因子药物不敏感，治疗效果差^［9-10］。反复玻璃体内注射存在眼内感染及眼内出血等风险。而且，长期抗血管内皮生长因子治疗可以引起脉络膜毛细血管和光感受器细胞超微结构及功能异常^［11］。因此，继续研究新的治疗RNV的药物对防盲、治盲工作有重大意义。
        Arresten是由Colorado等^［12］于2000年发现的一种强效血管生成抑制因子，为Ⅳ型胶原α1链的羧基末端的多肽片段，其对应的DNA编码序列长690 bp，肽链由230个氨基酸残基组成。研究显示，纯化重组Arresten在离体条件下可以有效抑制血管内皮细胞增殖，在荷瘤小鼠体内能够抑制肿瘤细胞增殖、迁移和血管形成^［13-14］。Chew等^［15］研究证实，Arresten与内皮抑素Endostatin均为来自胶原蛋白的血管生成抑制因子，尽管两者都无毒副作用，但Arresten比Endostatin更稳定，更能有效地保持其活性。本实验中我们利用OIR小鼠模型，证实Arresten可以有效抑制RNV形成。在OIR组中，小鼠视网膜无灌注区接近60％，且可见大量侵入玻璃体内的新生血管管腔形成；而在玻璃体内注射Arresten蛋白后，OIR小鼠视网膜无灌注区下降至30％以下，侵入玻璃体内的新生血管管腔也显著减少。该结果表明，Arresten蛋白可有效抑制RNV的形成。
        新生血管形成过程非常复杂，涉及多个病理机制，其中血管内皮细胞分裂、增殖是其重要环节之一^［16］。为进一步研究Arresten蛋白抑制氧诱导的小鼠RNV的作用机制。实验过程中我们采用MTT比色法，观察了不同浓度Arresten蛋白对人脐静脉内皮细胞增殖的抑制作用，结果表明，Arresten能有效抑制内皮细胞的增殖，且在一定浓度范围内，内皮细胞增殖的抑制率随着Arresten浓度的升高而增加，当Arresten浓度为1000 μg·L^-1时，其增殖抑制率接近60％。但再继续增加Arresten蛋白浓度，并不能进一步抑制内皮细胞的增殖。因此，我们认为Arresten有可能是通过抑制内皮细胞增殖而发挥抑制氧诱导的RNV形成的作用。