《眼科新进展》  2018年10期 959-963   出版日期：2018-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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针刺治疗绝经后期干眼患者的疗效及其泪液蛋白质组学研究


        干眼是指任何原因引起的泪液质和（或）量及动力学异常，导致泪膜不稳定和（或）眼表的异常，并伴有眼部不适的一类疾病。干眼在女性，尤其是绝经后期妇女中的发病率远超过男性，其传统治疗是使用人工泪液增加眼表泪液含量，或阻塞泪液排出系统^［1］。然而，这种治疗往往只能缓解症状，效果并不理想^［2］。激素替代治疗可以增加房水的分泌，但是不能提高干眼患者泪液的质量^［3］，且有增加冠心病、中风、乳腺和内分泌肿瘤的危险^［4-5］。近期研究显示，针刺疗法可能对干眼有潜在的治疗意义^［6］，然而其分子机制尚未见文献报道。本研究将具体分析针刺疗法治疗绝经后期干眼临床疗效及通过二维纳米液相色谱耦合串联质谱法 （two-dimensional nano-liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry，2D Nano-LC-MS/MS）进行泪液蛋白质组学研究，现报告如下。
1　资料与方法
1.1　一般资料　本研究为前瞻性随机对照研究。选取2014年9月至2015年6月于同济大学附属第十人民医院眼科门诊就诊的绝经后期干眼患者28例56眼，采用随机数字表法将患者分为单纯人工泪液（artificial tears，AT）治疗组（AT组）14例28眼及针刺治疗联合人工泪液（acupuncture plus artificial tears，AC+AT）治疗组（AC+AT组）14例28眼。纳入标准：（1）干眼诊断符合2013年角膜病学组干眼临床诊疗专家共识^［7］；（2）年龄>50岁，停经1 a以上的绝经后期女性；（3）既往或正在使用AT治疗者，或接受过AT治疗者。排除标准：（1）患有其他眼部疾病，如睑板腺功能障碍、睑缘炎、泪道阻塞、泪腺先天缺如或发育不良者或眼前节炎症，如沙眼、化学烧伤等其他角膜、结膜病变，睑结膜广泛瘢痕，青光眼长期滴用抗青光眼滴眼液者；（2）近6个月进行过外眼及内眼手术者，曾行泪下点栓塞、颌下腺移植手术者；（3）3个月内有角膜接触镜配戴史，眼部外伤史，对人工泪液过敏者；（4）卵巢或子宫切除术患者；（5）患有面部麻痹、糖尿病、甲状腺功能亢进等影响泪液分泌的疾病者；（6）患有自身免疫性疾病者；（7）合并心脑血管、肝、肾、造血系统等严重危及生命的原发性疾病及重度焦虑或重度抑郁者；（8）正在参加其他临床试验者。两组间治疗前各指标基线比较，差异均无统计学意义（均为P>0.05）。此项研究经同济大学附属第十人民医院伦理委员会批准。所有患者均签署受试者知情同意书。
1.2　方法
1.2.1　治疗步骤及疗效评定　AT组及AC+AT组均采用AT（玻璃酸钠滴眼液或羟糖甘滴眼液）作为基础治疗。AC+AT组患者同时接受针刺治疗，1周3次，每次治疗间隔1 d，每次持续30 min，共8周。针刺治疗由同一位中医医师完成，穴位包括睛明穴、攒竹穴、丝竹空穴、太阳穴、四白穴、合谷穴、风池穴、百会穴以及承泣穴。治疗持续2个月，治疗前后收集泪液用于泪液蛋白组学和Western blot分析。初次就诊时记录每例患者以下基本信息：干眼的病因及临床表现，既往使用过的眼液，眼表疾病指数（ocular surface disease index，OSDI）问卷，焦虑量表7条目（generalized anxiety disorder 7-item scale，GAD-7）^［8］，患者健康问卷9条目（patient health questionnaire 9-item，PHQ-9）^［9］，泪膜破裂时间（break-up time，BUT）以及S Ⅰ T结果。治疗前后由同一医师对AT组及AC+AT组以下指标进行评分：（1）OSDI评分：参照Schiffman等^［10］的研究方法进行评分；（2）症状及体征评分：症状评分包括视疲劳、流泪、畏光、异物感、烧灼感的评分，体征评分包括球结膜充血、结膜染色、角膜荧光染色、角膜/泪液征象，分值为0~4分，分数越高，表明患者临床症状越重；（3）BUT检测：在结膜囊内滴入荧光素溶液1滴，眨眼数次后保持睁眼状态，通过钴蓝色滤光片测定角膜出现第一个黑斑的时间即为BUT，>10 s为正常；（4）S Ⅰ T：在无表面麻醉下将试纸条一端5 mm处折叠成直角，将折叠端放置于患者下眼睑中外1/3处结膜囊内，另一端垂挂于睑外，闭眼5 min后取出试纸。记录湿长，≥10 mm/5 min为正常。
1.2.2　同位素标记相对和绝对定量试剂标记泪液蛋白及2D Nano-LC-MS/MS分析　将AC+AT组患者治疗前后的S Ⅰ T试纸条置于1 mL缓冲液（美国SCIEX公司）中，4 ℃孵化过夜。4 ℃条件下，13 000 r·min^-1离心10min，收集上清。采用二辛可宁酸法蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。提取200 μg蛋白，还原和烷基化后，胰蛋白酶消化，37 ℃过夜。按照同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）试剂盒（美国Applied Biosystems公司）说明书进行蛋白质标记：化学标签为114/115的iTRAQ试剂标记治疗前样品；化学标签为116/117的iTRAQ试剂标记治疗后样品。将标记后的样品经强阳离子柱分离纯化，并经高性能液相色谱分离。用AB SCIEXTripleTOF^TM 4600质谱仪（美国福斯特城公司）进行串联质谱分析，自动切换一级质谱和串联质谱分析。质谱分析设定标准：一级质谱分辨率荷质比范围为350~1250 m·z^-1，积累时间为每光谱250 ms，筛选出30个强度最高的离子进行二次扫描。串联质谱分辨率为100~1500 m·z^-1，动态排除时间为25 s。
1.2.3　iTRAQ数据和统计分析　采用ProteinPilot软件（版本4.5）进行肽识别和亚型特异性的量化。设定iTRAQ114信号作为内部参考信号，将可检测的蛋白质阈值设定为<0.01。蛋白质组数据库采用Homo sapiens（ΜniProKB） （http：//www.μniprot.org/μniprot）。差异表达蛋白设置如下：≥1.2表示上调（P<0.05），≤0.8表示下调（P<0.05）。
1.2.4　Western blot分析　为了证实2D Nano-LC-MS/MS的结果，对两组泪液样本中膜联蛋白A1和载脂蛋白A-I行Western blot分析，每组各选择8例患者的S Ⅰ T试纸条进行分析。试纸条置于200 μL缓冲液（180 μL磷酸盐缓冲液和20 μL蛋白酶抑制剂）中12 000 r·min^-1离心30 min后 4 ℃ 孵育24 h。酶标仪定量后电泳分离，转入硝酸纤维膜，室温封闭1 h。分别加入一抗膜联蛋白A1（兔抗膜联蛋白A1，1∶1000）或载脂蛋白A-I（鼠抗载脂蛋白A-I，1∶1000），湿盒内4 ℃过夜，加入二抗（抗兔IgG，1∶1000）室温下孵育1 h。在10 000~170 000 的蛋白质标准内估计检测到的蛋白质条带的分子量。
1.3　统计学分析　采用SPSS 24.0统计学软件进行数据分析。治疗前后临床参数以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验，治疗前后比较采用配对t检验，泪液蛋白质变化采用Pearson’s χ²检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　两组临床参数比较　与治疗前相比，两组患者治疗后OSDI评分、症状评分、体征评分以及BUT均明显改善，差异均有统计学意义（均为P=0.000），S Ⅰ T试验结果无明显变化（AT组P=0.28，AC+AT组P=0.360）。同AT组相比，针刺治疗后AC+AT组的OSDI评分明显好转，差异有统计学意义（P=0.000），其他临床参数两组比较差异均无统计学意义（均为P>0.05）。见表1。



2.2　泪液iTRAQ分析　iTRAQ结果成功鉴定出2411种蛋白，其中142种表达下调，169种表达上调。将蛋白种类按照亚细胞定位和功能类别进行分类。细胞定位显示，与治疗前相比，AC+AT组治疗后表达下调的蛋白主要为细胞质蛋白（44.37%）、分泌蛋白（10.56%）、膜蛋白（8.45%）和其他蛋白（8.45%），其中细胞质蛋白表达下调差异有统计学意义（P=0.000）。表达上调的蛋白主要为分泌蛋白（28.99%）、细胞质蛋白（24.26%）和其他蛋白（15.38%），其中分泌蛋白表达上调差异有统计学意义（P=0.000）。蛋白功能分析显示，与治疗前相比，AC+AT组治疗后表达下调的蛋白主要为参与代谢的蛋白（33.80%）、结合蛋白（14.79%）和细胞组分蛋白（13.38%），其中细胞组分蛋白表达下调差异有统计学意义（P=0.000）。表达上调的蛋白主要为参与代谢的蛋白（31.36%）、免疫蛋白（18.93%）以及结合蛋白（11.83%），其中免疫蛋白表达上调差异有统计学意义（P=0.040）。
        为了缩小分析范围，确定显著调节蛋白，将<0.5示为下调，>2.0示为上调。与治疗前相比，AC+AT组治疗后表达变化明显的蛋白包括参与免疫反应的蛋白（如多聚免疫球蛋白受体、补体C3）、凋亡相关蛋白（如膜联蛋白A1）、细胞成分蛋白及代谢相关蛋白（如肌球蛋白-14）、成神经细胞分化相关蛋白（AHNAK）。蛋白质位置及功能类别见表2。
2.3　Western blot分析验证泪液样本中蛋白质　进一步采用Western blot验证AT组及AC+AT组治疗前后膜联蛋白A1和载脂蛋白A-I变化。治疗后，两组膜联蛋白A1表达下调，载脂蛋白A-I表达上调，与蛋白质组学研究结果一致（图1）。




3　讨论
        近期研究显示，针刺疗法治疗干眼是有效的，并且在一定程度上优于人工泪液疗法^［11］。干眼的发病机制在传统意义上归因于泪液产生的减少和泪液稳定性的下降。传统人工泪液疗法只能暂时缓解干眼症状，无法针对炎症反应等导致干眼的根本原因^［12］。而针刺疗法可以增加泪液分泌，从根本上减轻干眼症状^［13］。此次研究验证了这些结论。另外，研究中单独比较了AT与AC+AT治疗方法。同AT组相比，AC+AT组OSDI评分和症状评分均有明显好转，这表明针刺疗法可改善干眼患者主观感受，可能同针刺疗法影响泪腺的合成和分泌，涉及神经系统、神经递质和内源性物质改变有关^［14］。近期发现，针刺作用机制可能影响氨基酸代谢和炎症通路，特别是Toll样受体信号通路、TNF信号通路和NF-κB信号通路^［15］，但未经临床研究验证，具体机制仍不明确。
        泪液在眼球表面的稳定中起到重要作用，泪液成分质或量的改变反映了眼表健康状况。在过去的研究中，质谱技术的进步增进了对泪液构成成分的认识。有研究运用液相色谱－质谱技术分析干燥综合征患者的唾液及泪液蛋白，发现干燥综合征患者泪液中CPNE1和PRDX3表达上调，故推测可通过液相色谱-质谱技术发现唾液腺和泪腺疾病的生物标志物，也可能适用于疾病的诊断、分期和随访监测^［16］。本研究运用iTRAQ 结合2D nano-LC-MS/MS进行干眼泪液蛋白基因组学研究，成功鉴定出2411种蛋白，其中142种表达下调，169种蛋白表达上调。通过Western blot鉴定了膜联蛋白A1和载脂蛋白A-I的表达水平，证实两组治疗后膜联蛋白A1表达下调，载脂蛋白A-I表达上调，与蛋白质组学研究结果一致。表达下调的蛋白质中，44.37%存在于细胞质；表达上调的蛋白质中，28.99%为分泌蛋白，这表明AC+AT治疗后，分泌蛋白表达上调，提示泪液产生增加及泪膜稳定性提高。
        研究显示，AC+AT治疗后炎症相关蛋白表达下调，提示抑制区域性炎症反应。有研究表明，炎症在干燥性角结膜炎的发病过程中起关键作用，抗炎治疗后干眼的症状和体征明显改善^［17］。膜联蛋白A1作为抑制固有免疫应答的内源性抗炎分子，能够促进吞噬细胞迁移以及白细胞浸润，起到了抗菌作用^［18］。此外，膜联蛋白A1可保护机体免受N-甲基-D-天冬氨酸诱导的脑损伤，膜联蛋白I和V对体外培养的神经元起到神经营养作用^［19］。因此，两组治疗后膜联蛋白A1表达下调提示眼表病理环境的改善。S100-A9作为一种炎症相关蛋白，主要在粒细胞和上皮细胞中表达，影响细胞增殖和分化^［20］，其在干眼患者的泪液中表达增加，且和症状的严重程度有关^［21］。A100-A9在干燥综合征患者中同样表达上调，且可介导兔模型产生自身免疫性泪腺炎^［22］。因此可以提出假设，针刺治疗后炎症相关蛋白表达下调，减少了炎症因子的释放，进而减轻了干眼的程度。
        干眼的发生不仅与慢性炎症有关，眼表微环境的紊乱、泪膜的不稳定、眼表保护机制的损伤均可导致干眼的发生。本研究显示，针刺联合人工泪液治疗后，眼表具有保护作用的一类蛋白表达上调。载脂蛋白A-I作为高密度脂蛋白的主要载脂蛋白，通常被认为只存在于肝脏和肠道。然而近年来发现，载脂蛋白A-I对角膜上皮细胞有保护作用，可以中和脂多糖毒性并减少细胞因子的产生，可能改善眼表上皮细胞的状态^［23］，在玻璃体和人视网膜色素上皮细胞中也可见其存在^［24］。丛生蛋白同样存在于在人类泪液中，参与维持蛋白质稳定、细胞稳定及抗炎等^［25］。针刺治疗后这些蛋白质的表达上调可能提示眼表状况的改善。
        综上所述，结合临床与基础研究，针刺疗法可增加绝经后期干眼妇女泪液蛋白质的合成和分泌，改善患者临床症状和体征。因此，针刺疗法可能成为治疗绝经后期干眼的一种有效的治疗方法，值得在临床上推广使用。