《眼科新进展》  2018年10期 947-950   出版日期：2018-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
miR-373在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的表达及其抑制侵袭及迁移能力的实验研究


        视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是儿童最常见、危害最大的眼内恶性肿瘤，恶性程度高，严重危害患儿视力并威胁患儿的生命［1］，并且其发病率逐年上升［2］。随着分子生物学的发展，分子靶向治疗已成为有较好前景的新的肿瘤治疗模式。目前RB发病及进展机制不明，尚缺乏有效的分子靶向治疗靶点。miRNA是一类非编码小分子RNA，在机体各种生物学调节过程中发挥着重要的作用，近年来发现miRNA表达异常与恶性肿瘤密切相关［3-4］。miR-373属于miRNA家族重要成员之一，研究表明miR-373在多种恶性肿瘤中表达异常，影响肿瘤细胞的侵袭及迁移能力［5-7］，但目前miR-373在RB中的相关研究甚少。Yang等［8］和Zhao等［9］研究发现，miR-373在RB组织中表达水平明显增高，推测miR-373与RB的发生发展有关，但其具体的作用机制尚不清楚。本研究利用qRT-PCR检测miR-373在RB细胞系中的表达情况，并探讨其对RB细胞侵袭及迁移能力的影响和可能的分子机制。
1　材料与方法
1.1　主要试剂　miR-373抑制物（miR-373 inhibitor）及阴性对照（inhibitor-NC）均购自上海吉玛制药公司，Trizol试剂及LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司，RNA逆转录试剂盒和qRT-PCR试剂盒购自大连宝生生物工程公司，miR-373及U6引物由广东锐博生物公司设计合成，Transwell小室购自美国Corning公司，基质胶购自美国BD公司，一抗E-Cadherin、Vimentin、N-Cadherin和GAPDH均购自美国CST公司，二抗购自美国Santa Cruz公司。
1.2　细胞培养和转染　人RB细胞系Y79、SO-RB50和人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181均购自美国ATCC菌种保藏中心，Y79和SO-RB50细胞在RPMI1640培养基（含体积分数10%胎牛血清）中培养，人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181在MCDB-131培养基（含体积分数10%胎牛血清）中培养。取生长状态良好的Y79细胞，接种于6孔细胞培养板，培养24 h后进行细胞转染操作，操作严格按照LipofectamineTM2000说明书操作将miR-373 inhibitor及inhibitor-NC转染至Y79细胞，转染后6 h更换新鲜培养液。转染后细胞分为miR-373 抑制物组和NC组，细胞转染后24 h采用qRT-PCR检测转染效率，进行后续细胞实验。
1.3　qRT-PCR 实验　严格按照Trizol试剂说明书提取Y79细胞总RNA，利用紫外分光光度计和甲醛琼脂糖变性对提取的总RNA进行纯度和含量鉴定。各组取1 μg总RNA，严格按逆转录试剂盒说明书提供的方法合成cDNA，以cDNA为模板，取PCR引物按照qRT-PCR试剂盒说明书配置反应体系，应用ABI7500实时荧光定量PCR仪进行PCR反应。miR-373上游引物：5’-GACGGCTCGAGGACCAAGG-GGCTGTATGCAC-3’，下游引物：5’-GCCAGAAGCTTCCTGCCCTGTTCATCTGCAGG-3’，反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 20 s，共40个循环，反应结束后记录PCR仪扩增曲线显示的Ct值，以U6作为内参基因，miR-373相对表达量采用2-△△Ct法计算，实验重复3次。
1.4　Transwell侵袭和迁移实验　将基质胶均匀涂抹Transwell小室上室，将其放置过夜成膜。第2天取200 μL含有100×103个Y79细胞的无血清DMEM培养基加入Transwell小室的上室，小室的下室加入500 μL含体积分数10% 胎牛血清的DMEM培养基，于37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱培养 24 h 后取出小室，棉签轻轻擦弃小室上室的细胞，40 g·L-1多聚甲醛固定30 min，PBS缓冲液清洗2遍，染色30 min后再用PBS缓冲液清洗2遍，室温风干，光学显微镜下观察，并随机取5个高倍视野计算细胞数。迁移实验时Transwell小室上室面不给予基质胶包被，余操作同侵袭实验。实验重复3次。
1.5　Western blot实验　应用RIPA细胞裂解液裂解细胞抽提Y79细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。每个样本取20 μg总蛋白上样，100 g·L-1 SDS-PAGE分离，湿转法电转移至PVDF膜，50 g·L-1脱脂奶粉封闭2 h，缓冲液洗涤3遍，加入一抗E-Cadherin、Vimentin、GAPDH，4 ℃孵育过夜，缓冲液洗涤3遍，加入二抗，室温孵育2 h后增强发光法（ECL）显影。应用Quantity One软件分析条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/GAPDH条带灰度值，实验重复3次。
1.6　统计学方法　本研究采用SPSS 20.0进行数据分析，计量资料采用x?±s表示，组间比较采用t检验或单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　miR-373在RB细胞中的表达　qRT-PCR结果显示，RB细胞系Y79、SO-RB50和人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181中miR-373的相对表达量分别为6.21±0.34、5.40±0.38、1.02±0.04。与细胞系ACBRI-181相比，细胞系Y79和SO-RB50中miR-373的表达水平明显上调（均为P＜0.01）。
2.2　转染miR-373 inhibitor对Y79细胞中miR-373表达的影响　qRT-PCR结果显示，miR-373抑制物组和NC组Y79细胞中miR-373的相对表达量分别为0.22±0.09、1.01±0.03。miR-373抑制物组明显低于NC组细胞（P＜0.01），证明miR-373 inhibitor转染成功，转染效率高。
2.3　下调Y79细胞中miR-373的表达对细胞的侵袭和迁移能力的影响　Transwell迁移和侵袭实验结果如图1所示，miR-373抑制物组和NC组迁移细胞数分别为（74±13）个、（180±17）个，miR-373抑制物组明显少于NC组（P＜0.05）；miR-373抑制物组和NC组侵袭细胞数分别为（51±9）个、（113±14）个，miR-373抑制物组明显少于NC组（P＜0.05）。结果提示下调Y79细胞miR-373的表达能够抑制细胞的迁移和侵袭能力。



2.4　miR-373调控EMT相关E-Cadherin、Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达　Western blot结果如图2所示，miR-373抑制物组与NC组E-Cadherin蛋白的相对表达量分别为0.40±0.08、0.20±0.06；与NC组比较，miR-373抑制物组E-Cadherin蛋白的表达水平明显升高（P＜0.05）。miR-373抑制物组与NC组Vimentin蛋白的相对表达量分别为0.17±0.06、0.51±0.10，miR-373抑制物组与NC组N-Cadherin蛋白的相对表达量分别为0.12±0.06、0.33±0.08。与NC组比较，miR-373抑制物组Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达水平均明显降低（均为P＜0.05）。



3　讨论
        RB是目前最常见的眼内恶性肿瘤，在中国每年约1000例新发病例，传统治疗模式常采用眼球摘除术、放疗及化疗等，严重影响患者视力和生存质量。近年来基因靶向治疗的发展为 RB的治疗提供了新的方向。目前研究已证实许多miRNA在RB的发生发展中发挥着重要的作用，参与调控癌细胞的迁移、侵袭、增殖、凋亡、细胞周期等肿瘤生物学行为。Zhao等［10］报道miR-320在RB组织和细胞系中表达明显下调，上调RB细胞中miR-320的表达可以抑制细胞的增殖、侵袭和迁移能力。Gui 等［11］发现miR-21在RB组织中表达明显上调，抑制miR-21的表达可以通过PTEN/PI3K/AKT通路抑制癌细胞的增殖、侵袭及迁移，促进其凋亡。Sun 等［12］研究证实miR-145在RB组织和细胞系中表达降低，miR-145能够通过下调ADAM19抑制RB细胞的增殖和侵袭。miR-373定位于染色体19q13.42，与miR-371a、miR-371b、miR-372同属于miR-371-373族［13］。近期研究发现miR-373在多种肿瘤细胞中均出现表达异常，与恶性肿瘤发生发展关系密切。miR-373在胃癌［5］、纤维肉瘤［14］、精原细胞癌［15］、膀胱癌［16］中表达升高，起着癌基因的作用。但miR-373在肝门胆管癌［7］、结肠癌［16］、胶质瘤［17］、非小细胞肺癌［18］等肿瘤中表达降低，起着抑癌基因的作用，因此可见miR-373在恶性肿瘤中的作用机制复杂，既有异常高表达，又有异常低表达。目前有关miR-373在RB中的研究甚少，并且作用机制尚不明确。本研究通过qRT-PCR检测miR-373在RB细胞系Y79、SO-RB50和人正常视网膜血管内皮细胞系ACBRI-181中的表达水平，发现miR-373在RB细胞系表达水平明显增高，提示miR-373在RB的发生发展中可能起着癌基因的作用。
        侵袭与转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，研究发现miR-373可以通过影响肿瘤细胞的侵袭及迁移参与肿瘤的发生发展［19］。为了观察miR-373对RB细胞侵袭和迁移能力的影响，本研究中我们通过Transwell侵袭和迁移实验发现，下调Y79细胞中miR-373的表达能够明显减少穿膜细胞的数量，证实抑制miR-373的表达能够明显抑制Y79细胞的侵袭和迁移能力。EMT在肿瘤的侵袭和迁移中激活是上皮细胞获得间质细胞特性的过程，也是肿瘤细胞获得侵袭性的关键分子事件，在恶性肿瘤的侵袭和迁移中发挥着重要作用［20］。较多的研究已表明miR-373可以通过调控EMT影响恶性肿瘤的迁移及侵袭能力。E-Cadherin蛋白是EMT过程中的上皮性标志蛋白，Vimentin和N-Cadherin蛋白是EMT过程中间质性标志蛋白，其异常表达被认为是EMT的分子标志［21］。Chen等［22］研究发现miR-373能够通过靶向调控TXNIP基因的表达诱导乳腺癌细胞EMT发生，E-Cadherin蛋白下降，Vimentin和N-Cadherin蛋白水平上升，促进癌细胞的侵袭和迁移能力。舌鳞状细胞癌［23］、非小细胞肺癌［24］、胰腺癌［25］中也发现miR-373可以诱导癌细胞EMT的发生，从而促进癌细胞的侵袭和迁移能力。但目前miR-373是否能够通过诱导EMT影响RB的侵袭及迁移能力尚未见相关报道。本研究中我们发现下调Y79细胞中miR-373 的表达，伴随着肿瘤细胞侵袭和迁移能力的下降，细胞中E-Cadherin的表达明显上升，同时Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达明显下降，证实抑制miR-373能够通过调控EMT降低Y79细胞的侵袭和迁移能力。
        综述所述，miR-373在RB细胞中表达明显增高，下调RB细胞中miR-373的表达水平可以通过调控EMT抑制癌细胞的侵袭和迁移能力，miR-373可能成为RB基因治疗的新的潜在分子靶点。