《眼科新进展》  2018年10期 940-942   出版日期：2018-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R

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白藜芦醇对急性低压缺氧诱导的大鼠视网膜损伤的保护作用


        高原地区由于海拔高、气压低，形成了特殊的气候环境。急进高原受到低氧等诸多因素的影响，会出现一系列高原反应，严重者可发生高原病，如高原肺水肿、高原脑水肿等^［1］。视网膜作为神经中枢系统的一部分，对缺氧非常敏感，低压缺氧状态下影响血-视网膜毛细血管屏障，进一步发生高原视网膜病变（high altitude retinopathy，HAR）^［1-2］。随着越来越多的人进入高原，发生HAR的几率也相应增加。近年来国内外学者对高原特发病的研究逐渐深入，但对于HAR发病从分子细胞水平的研究及干预措施方面的探讨相对较少，因此研究HAR的病因及治疗极为重要。白藜芦醇（resveratrol，RES）是植物产生的一种天然抗毒素，通过清除自由基、抗氧化的作用而发挥抗感染、抗氧化、脑和神经保护等作用^［3］。本研究通过模拟海拔5000 m的缺氧环境，探讨RES对急性低压缺氧诱导的大鼠视网膜损伤的干预作用及可能机制。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　动物来源　雄性清洁级SD大鼠72只［实验动物许可证号 SCXK（陕）2012-003］，由西安交通大学动物实验中心提供，体质量（210±20）g。
1.1.2　主要试剂与仪器　RES（北京博奥拓达科技有限公司），胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）抗体（Proteintech公司），缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）抗体 （Novusbio公司）。RNA逆转录试剂盒（TAKARA公司），SYBR GREEN 试剂盒、384孔RT-PCR板、RT-PCR反应膜（美国ABI公司），RT-PCR引物（上海生工生物工程有限公司），荧光定量PCR仪（美国ABI公司），荧光显微镜（日本Nikon公司）。
1.2　方法
1.2.1　动物造模　将72只健康SD大鼠随机分成3组：常氧对照组（n=24）、低氧模型组（n=24）和低氧+RES干预组（简称RES干预组；n=24）。常氧对照组大鼠在常氧环境下喂养，低氧模型组及RES干预组大鼠置于低压氧舱内（模拟5000 m的海拔高度），每24 h开舱0.5 h给大鼠加食、喂水，并给RES干预组大鼠每日腹腔注射30 mg·kg^-1 RES 1次，低氧模型组大鼠注射等量生理盐水，持续7 d。
1.2.2　免疫组织化学方法检测GFAP和HIF-1的表达　腹腔注射100 g·L^-1水合氯醛麻醉大鼠后，快速取出眼球，固定于40 g·L^-1多聚甲醛溶液中。将固定好的标本常规脱水、浸蜡、包埋，制成厚4 μm石蜡切片，均贴片于体积分数0.05%多聚赖氨酸处理的载玻片上。常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，抗原修复，滴加一抗（GFAP为1∶800；HIF-1为1∶30），4 ℃孵育过夜，滴加辣根酶标记的二抗，37 ℃孵育30 min，辣根过氧化物酶活性标记的工作液，免疫组织化学染色按ABC检测试剂盒（A-22066，Eugene，OR）操作步骤进行。加入DAB显色液，苏木素复染，脱水、透明，中性树胶封片后光学显微镜下观察结果。
1.2.3　RT-PCR检测核转录因子κB与脑源性神经营养因子mRNA的表达　腹腔注射100 g·L^-1水合氯醛麻醉大鼠，麻醉后快速取出眼球，去除晶状体与玻璃体，并完整剥离视网膜。加1 mL RNAiso Plus与视网膜混匀，提取细胞总RNA，按照SYBR GREEN试剂盒进行RT-PCR。脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）上游引物：5’-GGAGGCTAAGTGGAGCTGAC-3’，下游引物：5’-CATGTTCGATTCGAGTGGTCTT-3’；核转录因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）上游引物：5’-GCACCAAGACCGAAGCAA-3’，下游引物：5’-TCCCGTAACCGCGTAGTC-3’；β-actin上游引物：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，下游引物：5’-TTTAATGTCACGCGATTTC-3’。逆转录合成cDNA，将获取的cDNA分别加入各引物的反应体系中进行RT-PCR。以cDNA产物为模板，PCR 的循环参数：50 ℃反转录3 min，95 ℃初始PCR活化3 min，95 ℃ 变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环40次。扩增后进行熔解曲线分析和数据的定量分析。
1.3　统计学方法　使用SPSS 17.0统计学软件进行统计学分析。实验数据经W检验呈正态分布，采用x?±s表示，经Levene检验方差齐，用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　RES对视网膜GFAP和HIF-1表达的影响　常氧对照组视网膜神经纤维层及神经节细胞层GFAP呈阳性表达（图1A），低氧模型组视网膜GFAP阳性表达增强（图1B），而RES干预组视网膜GFAP的表达较低氧模型组减弱（图1C）。常氧对照组视网膜HIF-1少许表达（图2A），低氧模型组视网膜内界膜及内丛状层HIF-1阳性表达增强（图2B），而RES干预组视网膜HIF-1的表达较低氧模型组明显减弱（图2C）。
2.2　RES对视网膜BDNF、NF-κB mRNA表达的影响　3组大鼠视网膜BDNF mRNA和NF-κB mRNA的表达差异均有统计学意义（F=4.250、5.278；P=0.020、0.008）。低氧模型组BDNF mRNA（2.627±0.633）和NF-κB mRNA（1.712±0.198）的相对表达量较常氧对照组（2.000±0.518、1.053±0.483）均显著上调（P= 0.013、0.008）。与低氧模型组对比，RES干预组视网膜受损程度减轻，BDNF mRNA相对表达量显著下调（2.053±0.938，P= 0.024），而NF-κB mRNA相对表达量（1.481±0.397）无明显变化（P=0.455）。




3　讨论
        急进高原缺氧环境后，机体各组织器官都会出现不同程度的缺氧应激反应，而中枢神经系统对缺氧极为敏感，急性缺氧时整个神经系统兴奋性增强，视网膜作为中枢神经系统的延伸组织，对缺氧非常敏感，急性缺氧能使视网膜发生一系列病理生理变化。高原缺氧环境下检测视网膜电流图结果表明^［4］，在高原缺氧环境下视网膜的内核层、外核层及神经节细胞层功能均发生变化。
        以往研究表明，缺氧导致参与脑脊液-视神经屏障的重要细胞成分——脑膜上皮细胞的增殖率下降，引起内质网及线粒体功能障碍^［5-6］。通过本研究我们进一步探讨了低压缺氧对视网膜的影响以及RES的干预机制。GFAP是一种参与构成细胞骨架的中间丝蛋白，是胶质细胞的标志性蛋白，其过度表达用于标记星形胶质细胞发生反应性胶质化^［7］。HIF-1是一种氧依赖转录激活因子，是参与调节细胞内氧代谢的关键因子之一，在低氧适应机制中发挥重要的作用^［8］。免疫组织化学检测结果提示低氧环境使大鼠视网膜GFAP、HIF-1阳性表达增强。低氧环境下大鼠视网膜组织的GFAP表达增强可能提示胶质细胞的功能反应性提高。而氧感受器感受到缺氧后HIF-1被激活，从而通过调节目的基因维持氧稳态。RES干预组的GFAP、HIF-1表达明显减少，说明RES的保护作用可能是通过减轻低氧损伤而间接抑制了GFAP、HIF-1的表达，减轻了视网膜的缺氧应激反应，以维持视网膜的功能。
        BDNF是视网膜分泌的最丰富的因子之一，其在多种视网膜损伤条件下具有保护视神经和视网膜神经节细胞的作用。研究提示持续高眼压大鼠视网膜中上调的BDNF通过保护RGC树突可减少RGC的凋亡及延缓视力的丧失^［9］；糖尿病视网膜病变患者视网膜中BDNF减少，对早期患者可造成视网膜细胞凋亡和神经退行性病变，晚期患者则会出现神经和血管损伤^［10］。本研究结果表明，急性低压缺氧使大鼠视网膜中BDNF和NF-κB mRNA表达显著上调，RES下调了这两种基因的表达。其机制可能是急性低压缺氧对大鼠视网膜的损伤诱导了保护因子BDNF的上调，而RES对低氧诱导的视网膜损伤有抑制作用，从而间接下调了BDNF的表达。NF-κB具有多向转录调节作用的核蛋白因子，成为促炎症基因表达的重要枢纽，几乎存在于所有类型细胞中。NF-κB的异常活化可启动其下游基因的转录，增强促炎症因子作用及氧化应激反应，最终引起细胞凋亡。NF-κB对氧化应激的敏感性强，研究表明在缺氧诱导的氧化应激反应中，NF-κB的活化是缺氧转录反应的关键组成部分，可通过不同途径诱导多种细胞因子的表达，促进炎症反应^［11］。本研究发现急性缺氧使大鼠视网膜组织NF-κB表达上调，说明急性缺氧对大鼠视网膜的损伤作用可能跟NF-κB的激活有关，而NF-κB能够进一步介导炎症细胞因子IL-1α、IL-1β、IL-6的表达，故其机制可能是过度激活的NF-κB诱导了某些炎症因子的表达，促进了视网膜的损伤，而RES下调了NF-κB的表达。
        急性高原低压缺氧环境导致大鼠视网膜损伤，RES对此损伤有保护作用，其机制可能与调节GFAP、HIF-1、BDNF及NF-κB等的表达有关。高海拔急性缺氧环境对大鼠视网膜的损伤由多种因素造成的，其具体的机制有待进一步研究。