《眼科新进展》  2018年10期 930-934   出版日期:2018-10-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
microRNA146a在干眼中的表达及作用


        干眼是由于泪液的量或质或流体动力学异常引起的泪膜不稳定和(或)眼表损伤,从而导致眼部不适症状及视功能障碍的一类疾病[1]。泪膜不稳定和眼表炎症会导致眼部不适,如干燥感、异物感、畏光、发痒等,以及视觉受损,这些症状将影响患者的正常生活以及降低其生活质量[2]。尽管干眼的发病原因尚未明确,但目前有证据表明,炎症在干眼的发病中发挥着重要的作用[3]。microRNA是一种短小的非编码RNA片段,可调节编码RNA的表达,现已证明,microRNA可以调控许多重要的生理和病理过程[4]。其中,microRNA146a已证明在炎症反应中发挥着重要的作用,其在炎症中的作用靶点为白细胞介素(interleukin,IL)-1受体相关激酶1(IL-1 receptor-associated kinase 1,IRAK1)和肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor-6,TRAF6)[5-6]。但目前,microRNA146a在干眼炎症中的调控作用并不明确。因此,本研究以小鼠中重度干眼模型为研究对象,初步探讨microRNA146a在干眼炎症中的作用。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验动物及分组 健康、清洁级的5周龄雄性BALB/c小鼠30只,购于协和医学院血液学研究所。经裂隙灯筛查,筛选出眼表无异常的小鼠20只。小鼠左眼作为正常对照组(20眼),右眼作为干眼组(20眼)。在整个实验过程中,小鼠饲养在标准环境中:室温(25±1)℃,相对湿度60%±10%,灯光模拟12 h昼夜交替(早上8∶00至晚上 8∶00)[7]。实验动物的使用遵循国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》,本研究经天津医科大学伦理委员会审查批准。
1.1.2 主要试剂及仪器 苯扎氯铵(美国Sigma公司),荧光素钠(天津晶明新技术开发有限公司),Trizol(美国Invitrogen,Thermo Fisher公司),反转录试剂盒(美国PROMEGA公司),实时荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司),眼科手术显微镜(德国ZEISS公司),中性福尔马林固定液(江苏世泰公司)。
1.2 方法
1.2.1 小鼠干眼模型的建立 配制 2 g·L-1苯扎氯铵溶液滴小鼠右眼,每次5 μL,每日2次,持续14 d,拟建立中重度干眼模型。小鼠左眼滴磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution,PBS),每次5 μL,每日2次,持续14 d,作为正常对照[7]
1.2.2 干眼指标的检查 检查均由同一人完成,每次检查时间、地点、温度、湿度和亮度均相同。在完成造模的3 d后,用50 g·L-1水合氯醛按10 mL·kg-1体质量腹腔注射麻醉小鼠,使其保持静止状态,从而便于进行泪膜破裂时间(break-up time,BUT)和角膜荧光素钠染色(fluorescein staining,FLS)评分。
1.2.2.1 BUT 100 g·L-1荧光素钠溶液1 μL滴入小鼠结膜囊,10 s后人为辅助瞬目3次,之后用左手拇指和食指分开小鼠上下眼睑,在裂隙灯下观察并计时,以睑裂打开至泪膜出现第一个破裂点的时长为BUT,每眼观察3次取平均值。
1.2.2.2 角膜FLS评分 100 g·L-1荧光素钠溶液滴入小鼠结膜囊,人为辅助小鼠瞬目3次,待90 s后在裂隙灯钴蓝光下观察。将小鼠角膜分为鼻上、鼻下、颞上、颞下四个象限,每个象限分别评分,之后相加求和。评分标准[7]为:无着染为0分;轻微点状着染并少于30个点为1分;着染≥30个点但不弥散为2分;弥散着染且无斑块着染为3分;斑块着染为4分。总分值为16分。
1.2.3 组织病理学检查 在干眼相关检查完成后,随机选取10只小鼠进行组织病理学检查。颈椎脱臼法处死小鼠,取下包括睑结膜、穹隆结膜、球结膜在内的整个眼球。用体积分数10%中性福尔马林固定液固定,常温下梯度酒精(体积分数依次为70%、80%、90%、95%和100%)脱水,二甲苯透明后浸蜡、包埋,之后平行于眼轴方向切片,厚度为5 μm。切片进行HE染色,显微镜下观察角膜和结膜病理学改变;对结膜行PAS染色,记录杯状细胞的数量。
1.2.4 总RNA抽提及反转录反应 剩余10只小鼠进行角膜和结膜的总RNA抽提。颈椎脱臼法处死小鼠,在解剖显微镜下取小鼠角膜和结膜组织,使用Trizol法抽提总RNA,参照试剂盒说明书进行反转录。microRNA146a反转录体系:以mRNA为模板,20 μL体系中包含MMLV RT Buffer 4.0 μL,dNTP 0.75 μL,U6 1.2 μL,miR-146a-5p RT 1.2 μL,RNA酶抑制剂 0.25 μL,M-MLV RT 0.2 μL,mRNA 3.0 μL,ddH2O 9.4 μL;25 ℃持续30 min,42 ℃持续30 min,85 ℃持续5 min,-20 ℃保存,备用。IL-1、IL-6、IL-8、IRAK1、TRAF6反转录体系:以mRNA为模板,25 μL体系中包含Oligo(DT) 1 μL,mRNA 14 μL,MMLV RT Buffer 5 μL,dNTP 2 μL,RNA酶抑制剂 1 μL,M-MLV RT 1 μL,DEPC 1 μL;42 ℃持续60 min,94 ℃持续10 min,-20 ℃保存,备用。
1.2.5 实时荧光定量PCR检测 以反转录合成的cDNA为模板,microRNA146a采用20 μL反应体系,该体系中包含SYBR 10 μL,cDNA 2 μL,microRNA146a(mix) 0.4 μL,ROX 0.4 μL,ddH2O 7.2 μL;IL-1、IRAK1、TRAF6采用20 μL反应体系,该体系中包含SYBR 10 μL,目的基因上游 0.5 μL,目的基因下游 0.5 μL,ROX 0.4 μL,ddH2O 6.6 μL,cDNA 2 μL;均为95 ℃持续3 min,95 ℃持续12 s,62 ℃持续40 s,40个循环。引物序列为:IL-1:上游引物:5’-GCCACCAAAGAACAAAGTCGG-3’,下游引物:5’-ACAGACTGTCAGCACTTCCC-3’;IL-6:上游引物:5’-GGAGTGGCTAAGGACCAAGA-3’,下游引物:5’-TCTGACCACAGTGAGGAATGTC-3’;IL-8:上游引物:5’-TGCATGGACAGTCATCCACC-3’,下游引物:5’-ATGACAGACCACAGAACGGC-3’;IRAK1:上游引物:5’-ATCAGGCTTTTTCCCAGGCT-3’,下游引物:5’-GCACACTATGAGAACTTCCAAGC-3’;TRAF6:上游引物:5’-AATCCCACGGAACCCCAAAG-3’,下游引物:5’-ACCCATGTCAAAGCGGGTAG-3’;U6:上游引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,下游引物:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’;microRNA146a:上游引物:5’-CTGCCGCTGAGAACTGAATT-3’,下游引物:5’-CAGAGCAGGGTCCGAGGTA-3’。
1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,数据采用均数±标准差(x?±s)表示,对BUT和FLS评分进行配对样本t检验,对实时荧光定量PCR数据采用独立样本t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两组干眼观察指标比较
2.1.1 BUT 干眼组小鼠BUT为(3.640±0.493)s,明显低于正常对照组的(10.645±0.583)s,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.1.2 FLS 干眼组角膜FLS评分为(14.650±0.860)分,明显高于正常对照组的(1.233±0.927)分,差异有统计学意义(P<0.05)。干眼组角膜可见大面积荧光素钠着染,而正常对照组角膜荧光素钠着染面积明显小于干眼组(图1)。



2.2 组织病理学检测结果
2.2.1 HE染色结果分析 光镜下观察角膜和结膜组织结构的变化。正常对照组角膜上皮排列整齐,细胞为4~5层,基底细胞为一单层柱状细胞,排列紧密整齐;基质层胶原纤维排列整齐,内皮细胞规整,平滑。干眼组角膜上皮欠平整,细胞排列欠规整,细胞数量和细胞层数均明显增多;角膜基质层胶原纤维排列紊乱、肿胀,成纤维细胞呈活化状态,细胞数目增多且细胞体积增大(图2)。与正常对照组相比,干眼组小鼠结膜上皮细胞数目增多,细胞排列欠规整,并伴有缺损(图3)。




2.2.2 结膜PAS染色结果 PAS染色后,光镜下观察结膜杯状细胞,干眼组小鼠结膜中杯状细胞染色明显少于正常对照组(图4)。在高倍视野下,用 ImagePro 分别计算正常对照组和干眼组小鼠结膜杯状细胞的个数。结果显示:干眼组结膜杯状细胞数量为(9.500±4.506)个,明显低于正常对照组的(29.667±8.756)个,差异有统计学意义(P<0.05)。
2.3 角膜和结膜中microRNA146a、IL-1、IL-6、IL-8、IRAK1、TRAF6的表达 相比于正常对照组角膜,干眼组角膜中microRNA146a、IL-1、IL-6、IL-8、TRAF6的相对表达量均升高,而IRAK1的相对表达量降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。相比于正常对照组,干眼组结膜中microRNA146a、IL-1、IL-6、IL-8、IRAK1的相对表达量均升高,而TRAF6的相对表达量降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)。见表1和表2。





3 讨论
        干眼是一种多因素疾病,其发病机制极为复杂。但目前有越来越多的证据表明,炎症在干眼发病机制中发挥了极为重要的作用[8-9]。干眼时泪腺和结膜中会伴有大量免疫细胞浸润,且伴有炎症因子表达升高,进而又加重了干眼的症状和疾病的进展[10]。在本研究中,我们用2 g·L-1苯扎氯铵溶液滴眼14 d诱导小鼠中重度干眼模型,滴眼完成3 d后在裂隙灯下可观察到,干眼组BUT明显低于正常对照组,FLS评分明显高于正常对照组,且角膜荧光素钠着染面积明显多于正常对照组。角膜组织HE染色显示,干眼组小鼠角膜上皮细胞数量和细胞层数相较于正常对照组均增多,并伴有细胞不规则;结膜组织HE染色显示,干眼组小鼠结膜上皮细胞数量增多,细胞排列欠规整,并伴有缺损。结膜PAS染色结果示,干眼组结膜杯状细胞数量明显低于正常对照组。以上结果均可说明小鼠中重度干眼模型诱导成功,并与之前干眼实验研究结果相符[7,11]
        microRNA在包括炎症反应在内的多种病理和生理过程中都发挥着重要作用。已有大量研究证实,为了防止炎症发展,机体可建立多种炎症级联反应,通过正向和负向的调控机制来调节炎症通路,其中核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)是最为重要的一条炎症通路;而microRNA146a可以通过负向调控NF-κB通路中IRAK1和TRAF6的表达来抑制通路活性,从而减少炎症因子的表达[6,12-13]。虽然已有大量研究[14-17]证实,microRNA146a可以调控多种疾病的发病过程,但其对干眼炎症反应的调控作用还尚不清楚。本研究中,我们建立了中重度干眼小鼠模型,通过实时荧光定量PCR检测发现:相比于正常对照组,干眼组小鼠角膜和结膜中IL-1、IL-6、IL-8和microRNA146a的相对表达量均升高,这证明炎症是干眼发病的重要机制,并且机体通过增加microRNA146a的表达形成负反馈调节机制来抑制炎症反应的进展。干眼组角膜中TRAF6的相对表达量相比于正常对照组有所升高,而IRAK1的相对表达量相比于正常对照组降低,说明在干眼角膜炎症中,microRNA146a的主要靶点是IRAK1,而非TRAF6;干眼组结膜中IRAK1的相对表达量相比于正常对照组升高,而TRAF6的相对表达量相比于正常对照组降低,说明在干眼结膜炎症中,microRNA146a的主要靶点是TRAF6,而非IRAK1。该结果中角膜与结膜之间IRAK1和TRAF6表达的差异性可以说明,microRNA146a对其靶点的抑制作用在同一疾病的不同组织中具有特异性[18]。这点与文献报道相通,如在糖尿病大鼠模型的肾脏中可检测出microRNA146a相对表达量较正常对照组升高,而IRAK1和TRAF6相对表达量没有明显变化[19];而在糖尿病大鼠坐骨神经中,microRNA146a相对表达量较正常对照组升高,TRAF6相对表达量降低,IRAK1相对表达量没有明显变化[20]。尽管在本实验中干眼组小鼠已通过增加microRNA146a的表达形成对炎症反应的负反馈调节机制,但其炎症因子的表达还尚未出现下降。我们推测其原因为:(1)可能与microRNA146a对IRAK1和TRAF6的抑制作用在不同疾病和组织中的强度和选择性不同有关[18];(2)不能排除机体生理上的控制和其他对NF-κB通路起正向调控因子的作用,例如microRNA155可以通过负向调节含有SH2结构的5’肌醇磷酸酶-1和细胞因子信号转导抑制因子1的表达从而促进NF-κB通路的活性,增加炎症因子的表达[6];(3)Whichard等[21]研究证明,从转录物的保存和降解到miRNA-mRNA复合体的合成是一个复杂而又动态的过程,并且miRNA的合成速率也是衡量其对炎症等生物过程调控作用的关键因素;(4)炎症反应中IL-1、IL-6、IL-8的升高可以促使机体形成负反馈调节机制,从而使microRNA146a表达升高,但其升高的较为缓慢,可能在炎症后期降低炎症因子的表达[6]
        本研究通过诱导中重度小鼠干眼模型,对microRNA146a在角膜和结膜中对IRAK1和TRAF6的调控有了初步的了解,进一步完善了干眼的发病机制。但microRNA146a对干眼炎症反应的具体调控机制以及microRNA146a与其他调控因子的协同或拮抗作用还有待进一步研究。