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《眼科新进展》 2018年9期 801-803 出版日期：2018-09-05 ISSN:1003-5141 CN:41-1105/R

CRISPR-Cas9基因编辑技术在眼科疾病中的应用

        1987年，Ishino等^［1］在研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时发现其下游有14个29 bp的重复序列被32~33 bp的非重复间隔序列隔开。随后，在许多细菌和古生菌的基因组中发现这一序列。2002年，Jansen等^［2］将这一序列命名为规律成簇间隔短回文重复（clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR）基因座，同时，他们还在CRISPR基因座的一侧发现了CRISPR相关基因（Cas）。自CRISPR基因座被发现以来，关于其功能的假说不断被提出，直到2005年，3个研究团队发现CRISPR基因座的间隔序列与噬菌体的基因序列高度同源，故猜测CRISPR基因座可能与宿主抵抗外源遗传物质入侵的免疫保护机制相关^［3-5］。2007年，Barrangou等^［6］在嗜热链球菌（streptococcus thermophilus）中证实了间隔序列是由入侵的噬菌体DNA衍生而来，他们还指出，Cas基因是CRISPR基因座发挥作用所必需的，因此，将这一系统称作CRISPR-Cas系统。
        2015年，Makarova等^［7］将CRISPR-Cas系统分为2大类5种类型。1类（Class 1）系统包含Ⅰ型（Type Ⅰ）、Ⅲ型（Type Ⅲ）和Ⅳ型（Type Ⅳ）；2类（Class 2）系统包含Ⅱ型（Type Ⅱ）和Ⅴ型（Type Ⅴ）。由于Ⅱ型CRISPR-Cas系统中行使核酸切割功能的蛋白只有Cas9，因此，经改造之后，CRISPR-Cas9技术被广泛用于不同物种的基因组编辑和疾病治疗^［8］。本文主要综述CRISPR-Cas9技术在构建眼科疾病模型和治疗眼科疾病中的应用。
1　CRISPR-Cas9技术在构建眼科疾病模型中的应用
自CRISPR-Cas9系统被改造为一种由RNA引导核酸内切酶的基因编辑技术之后，CRISPR-Cas9技术被成功用于癌症^［9］、白化病^［10］和衰老^［11］等多种疾病模型的构建，下面主要介绍CRISPR-Cas9技术在构建眼科疾病模型中的应用。
1.1　成视网膜细胞瘤　成视网膜细胞瘤（retinoblastoma，RB）是由Retinoblastoma 1（Rb1）双等位基因失活导致的一种遗传性儿童眼部肿瘤^［12］。由于缺少临床前研究模型，尽管近年来RB的药物治愈率有所增加，但目前尚无可用的分子靶向治疗。Naert等^［13］试图利用CRISPR-Cas9技术构建非洲爪蟾的RB模型。结果显示，与小鼠的研究相似，Rb1或Retinoblastoma-like 1（Rbl1）基因突变的非洲爪蟾发育正常并且不能形成肿瘤；而Rb1和Rbl1基因同时发生突变，则导致蝌蚪和幼蛙出现RB和脑瘤。该研究首次建立了非哺乳类的RB模型，为研究该疾病的分子治疗提供可用模型。
1.2　白内障　以晶状体混浊为特征的先天性白内障是儿童失明的主要原因，10 000个新生儿中有0.6~6.0个出现先天性失明^［14］。
        晶状体特异间隙连接蛋白GJA1、GJA3和GJA8在从高代谢活性细胞向低代谢活性细胞传递信息的过程中起至关重要的作用。因此，编码这3个蛋白的基因是脊椎动物晶状体发育和功能的重要基因^［15］。Yuan等^［16］利用CRISPR-Cas9技术成功敲除家兔的GJA8基因，导致家兔出现小眼、小晶状体和白内障的症状。这一新型的家兔白内障模型成为预防和治疗白内障重要的药物筛选工具。
        晶状体家族基因αA-crystallin（CRYAA）和αB-crystallin（CRYAB）的突变能够引起先天性白内障^［17-18］。其中，CRYAA基因在晶状体内高表达，并参与维持其结构和透明度。Yuan等^［19］将Cas9 mRNA和sgRNA共注射到家兔受精卵中，成功敲除了CRYAA基因，构建了具有先天性白内障、小眼、视力模糊、晶状体萎缩和晶状体纤维不分化等表型的家兔白内障模型。这一研究为进一步探讨CRYAA基因突变与人类先天性白内障之间的关系提供了新的动物模型。
2　CRISPR-Cas9技术在治疗眼科疾病中的应用
CRISPR-Cas9技术最具前景的应用是对遗传疾病的基因治疗，目前，该技术已成功用于杜氏肌营养不良症^［20］、血友病^［21］、酪氨酸血症^［22］和亨廷顿舞蹈症^［23］等多种遗传疾病的基因治疗，下面主要介绍CRISPR-Cas9技术在眼科疾病中的应用。
2.1　色素性视网膜炎　色素性视网膜炎（retinitis pigmentosa，RP）是一类遗传性视网膜退行性疾病，包括常染色体隐性遗传、常染色体显性遗传和伴X染色体连锁遗传3种，该病的主要特征是进行性光感受器细胞丧失导致视网膜变性萎缩^［24］。目前，临床中尚无有效治疗RP的方法。近年来，CRISPR-Cas9技术的发展给治疗RP带来了新希望。
        “rodless”（rd1）小鼠是临床前研究RP常用的常染色体隐性遗传模型，这种小鼠的Pde6b基因上有2个突变位点：一个是无义突变位点（Y374X），另一个是白血病病毒的内含子插入突变（Xmv-28）。目前，尚无确切证据表明哪一个突变位点是导致RP的关键原因。Wu等^［25］选择rd1小鼠作为研究对象，试图利用CRISPR-Cas9技术修复Pde6b基因的Y374X突变，达到治疗RP的目的。在该研究中，F0代的Y374X修复小鼠视网膜结构恢复正常，并且视网膜电流图显示出生后30 d（P30）的Y374X修复小鼠在视杆、视锥和视杆视锥反应中的表现与野生型小鼠相似。这一研究证明，CRISPR-Cas9基因治疗技术可有效修复rd1小鼠的临床症状。此外，该研究还间接证明Y374X突变位点是导致RP的关键原因。
        视紫红质（Rho）基因编码的视杆受体蛋白与视网膜结合能够感受到光，并且启动视杆光感受器的光传导级联反应^［26］。大鼠Rho基因S334ter突变（RhoS334）是一种常染色体显性遗传的RP模型。RhoS334突变使大鼠出现与人的Ⅰ型RHO相似的持续光感受器损失和视力下降。Bakondi等^［27］将特异性sgRNA和Cas9注射到出生后0 d（P0）的RhoS334突变大鼠单侧视网膜下，并利用电穿孔法使其进入细胞内，从而选择性地消除携带显性RhoS334突变的等位基因导致的影响。小鼠Rho基因的P23H突变也是一种常染色体显性遗传的RP模型。Giannelli等^［28］利用CRISPR-Cas9技术选择性地消除小鼠Rho基因的P23H突变，从而改善了视网膜的功能。由此可见，在活体内利用CRISPR-Cas9技术选择性地消除Rho基因突变可以阻止遗传性视网膜变性。
        RPGR基因突变能够导致X染色体连锁遗传的RP。Bassuk等^［29］将从X染色体连锁遗传的RP患者皮肤活检组织中获得的携带RPGR基因c.3070G>T突变的成纤维细胞诱导为多能干细胞（iPSCs），利用CRISPR-cas9技术将sgRNAs、Cas9和一段同源模板转入iPSCs，最终发现，13%的RPGR基因得到修正，并转化为野生型等位基因。这一研究将患者来源的iPSCs经基因编辑用于视网膜移植，为治疗遗传性RP提供了前期基础。
2.2　Leber先天性黑矇10　Leber先天性黑矇10（Leber congenital amaurosis 10，LCA10）是由Cep290基因内含子突变导致的一种严重的视网膜营养障碍性疾病，该基因突变导致产生一种可变剪接位点，使得一半细胞内的该基因编码时出现提前终止密码子^［30］。Ruan等^［31］利用双AAV系统介导的CRISPR-Cas9技术将小鼠视网膜Cep290基因内含子的突变位点删除。该研究为治疗LCA10提供了潜在的方法。
2.3　原发性开角型青光眼　原发性开角型青光眼（primary open-angle glaucoma，POAG）是全球不可逆视力丧失的主要原因之一，高眼压是其主要危险因素。MYOC基因突变使蛋白质错误折叠，造成调节眼压的小梁网的内质网压力增加，导致常染色体显性遗传的POAG^［32］。Jain等^［33］利用CRISPR-Cas9技术在MYOC基因突变的小鼠POAG模型中降低MYOC突变基因的表达，从而减缓了小梁网的内质网压力，降低眼压，阻止了进一步的青光眼损伤。此外，该研究应用体外人体器官培养系统证明了该方法治疗人类青光眼的可行性。
2.4　白内障　小鼠Crygc基因3号外显子1碱基的突变可导致显性遗传的白内障^［34］。Wu等^［35］利用该小鼠作为模型，将特异的sgRNA、Cas9 mRNA和外源的供体DNA共注射到受精卵中，修复了Crygc基因的突变，治愈了小鼠的白内障，并且可以稳定遗传给后代。该研究为利用CRISPR-Cas9技术治疗遗传性疾病提供了可靠证据。
3　结语与展望
        CRISPR-Cas9技术在构建疾病模型中的应用广泛，但在治疗疾病方面仍主要停留在动物水平。尽管CRISPR-Cas9技术有很多优势，但仍存在一定的缺陷，例如脱靶效率难以避免^［36］。另外，由于伦理学问题，近期该技术较难直接应用于人类疾病的治疗中。因此，寻找更加安全高效的基因编辑手段将有助于推动基因治疗研究的发展。