《眼科新进展》  2018年7期 638-642   出版日期：2018-07-05   ISSN:1003-5141   CN:41-1105/R
表没食子儿茶素没食子酸酯对视网膜色素上皮细胞增殖及相关因子表达的影响


    视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞是增生性玻璃体视网膜病变（proliferative vitreoretinopathy，PVR）发病最关键的细胞，贯穿于PVR发生、发展的全过程。PVR是孔源性视网膜脱离常见的并发症，常引起手术复位失败，导致严重的视功能丧失或失明［1］。RPE细胞是PVR发病过程中主要的效应细胞，其异常增生和迁移常导致视网膜前后面增生膜形成，对视功能造成严重影响。当前，临床上主要利用玻璃体视网膜手术治疗和预防PVR，但手术只能清除病变的玻璃体，解除增生膜对视网膜的牵拉，不能预防和阻止RPE细胞增生和迁移，无法完全清除导致PVR病变的关键因素，因而PVR的复发率较高。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是从食用植物茶叶中提取的一种天然有效成分，它具有抗氧化、抗肿瘤、保护神经系统、保护心脑血管、抗炎等多种生物学活性［2］，在心血管、神经系统及癌症治疗中研究较多，但是在眼科领域报道较少。我们通过体外实验研究EGCG对人RPE细胞的增殖抑制作用，为临床研究和治疗PVR提供一定的理论依据。1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　细胞和主要试剂　人RPE-19细胞株由桂林医学院科学实验中心提供；DMEM培养基、2.5 g·L-1胰蛋白酶、胎牛血清购自美国 GIBCO 公司，二甲基亚砜购自美国YCLONE 公司，青霉素、链霉素购自大连美罗制药厂，EGCG、 MTT购自Sigma公司，HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit和UltraSYBR Mixture购自北京康维生物有限公司，RIPA、PMSF和BCA蛋白定量试剂盒购自上海碧云天有限公司，ECL显影试剂盒购自美国伯乐公司，色素上皮衍生因子受体（pigment epithelium derived factor receptor,PDGFR-α)及核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB）购自沈阳万类生物有限公司，β-actin一抗、辣根过氧化物酶标记的鼠二抗及兔二抗购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.1.2　主要仪器　超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），倒置相差显微镜（日本Olympus），BD FACSAria Ⅲ流式细胞仪（美国BD公司），CO2培养箱、ABI7500 fast荧光定量PCR仪（美国赛默飞公司），低温高速台式离心机（美国贝克曼公司），酶标仪（瑞士帝肯公司），蛋白电泳及转印系统（美国伯乐公司）。
1.2　方法
1.2.1　细胞培养及药物配制　人RPE细胞常规培养于含体积分数10% 胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、体积分数5%CO2 培养箱中培养，1～2 d传代1次，取对数生长期细胞进行实验。EGCG 以磷酸盐缓冲液溶解成80 g·L-1，最终以DMEM培养液稀释至终浓度使用。
1.2.2　MTT法检测细胞增殖抑制率　实验设阴性对照组，40 mg·L-1、 80 mg·L-1、 160 mg·L-1 EGCG 3个浓度药物处理组，每组设3个复孔，取对数生长期的人RPE 细胞，胰蛋白酶溶液充分消化后用DMEM 培养液稀释成单细胞悬液，调整细胞密度为20×103个·L-1，阴性对照组和药物处理组每孔加入细胞悬液100 μL，空白对照组加入 200 μL 培养液接种于96孔培养板中，接种过程持续吹打和晃动保持细胞分布均匀，置于37 ℃ 、体积分数5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁后，弃掉原培养基，每孔加入含药培养基 200 μL，放入培养箱内继续培养24 h、48 h、72 h，药物作用结束后，每孔加入20 μL 的 MTT （5 g·L-1），在培养箱内培养4 h后，在酶标仪490 nm 波长处测定吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率=（阴性对照组A值-药物处理组A值）/（阴性对照组A值-空白对照组A值）×100%，通过IC50计算软件计算IC50值，实验重复3次。
1.2.3　流式细胞术检测细胞周期　取对数生长期的人RPE细胞，以10×106个·L-1细胞密度8 mL接种于10 cm培养皿中，待细胞贴壁后，实验组加入终浓度为40 mg·L-1、80 mg·L-1、160 mg·L-1的EGCG，阴性对照组加入不含药物的培养基。继续培养48 h后，胰蛋白酶消化细胞，离心，预冷磷酸盐缓冲液（pH=7.4）洗2次，然后快速置于预冷体积分数为70%的乙醇溶液中固定，-20 ℃冰箱过夜。次日弃去冰乙醇，用预冷的磷酸盐缓冲液洗涤后加0.5 mL的RNase（100 mg·L-1），悬浮细胞后，37 ℃水浴30 min，加25 μL碘化丙啶（PI，1 g ·L-1），避光染色30 min。在激发波长488 nm条件下用流式细胞仪测定细胞周期。数据采用流式细胞仪自带的软件分析G1/G0期、S期和G2/M期细胞的比例。实验均重复3次。
1.2.4　实时荧光定量PCR分析细胞周期相关基因的表达　将对数生长期的人RPE细胞，以 0.8×106个接种于10 cm细胞培养皿，待细胞贴壁后，加入不用浓度的EGCG，阴性对照组加入不含药物的培养基，药物处理细胞48 h后，收集细胞，采用TRIzol 法抽提细胞总mRNA，利用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒将mRNA逆转录成cDNA。采用 UltraSYBR Mixture嵌合荧光进行PCR反应，反应体系20 μL，引物由Invitrogen上海公司合成，内参为β-actin。反应结束后行产物的熔解曲线分析，排除非特异性扩增及引物二聚体等因素，计算P21、P27 mRNA的相对表达量。
1.2.5　Western blot检测PDGFR-α、NF-κB和IκB蛋白的表达　取对数生长期人RPE细胞，消化后制成单细胞悬液，以0.8×106个接种于10 cm细胞培养皿，加入不同浓度EGCG作用48 h后，终止培养，收集细胞，用4 ℃预冷的磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次，加入400 μL细胞裂解液RIPA，冰上裂解30 min后，12×103 r·min-1离心30 min，取蛋白上清，BCA法测蛋白浓度，分装保存。每孔加30 μg上样蛋白进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白，350 V湿转120 min至硝酸纤维素膜上，用50 g·L-1脱脂牛奶的封闭液4 ℃封闭1 h。洗膜后，加入一抗（1∶500稀释）孵育过夜，PBST洗4次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶2000稀释），常温孵育1 h。将化学发光增强液A 和B 两种试剂等体积混匀，滴加在硝酸纤维素膜上，胶片显影。用Bio-Rad凝胶成像系统获取图像，实验重复3次。
1.3　统计学方法　采用SPSS 17.0统计软件对数据进行统计分析，以（x?±s）表示数据结果，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。
2　结果
2.1　EGCG对人RPE细胞增殖的抑制作用　MTT实验结果显示，40 mg·L-1、80 mg·L-1、160 mg·L-1 EGCG药物处理组随着作用时间的延长，对人RPE细胞的增殖抑制作用也逐渐增强；随着药物浓度的增加，EGCG的增殖抑制作用也增强（均为P<0.05）。160 mg·L-1 的EGCG 在72 h的细胞增殖抑制率达到81.11%，说明EGCG能明显抑制人RPE细胞的增殖，其抑制作用呈浓度依赖性和时间依赖性，见表1。



2.2　EGCG对人RPE细胞周期的影响　随着EGCG浓度的增加，培养的人RPE细胞中G1期和G2期细胞比例减少，S期细胞比例增加，80 mg·L-1、160 mg·L-1EGCG药物处理组S期细胞比例与阴性对照组相比增加极显著（均为P<0.05），说明EGCG可使RPE细胞发生S期阻滞。EGCG对细胞周期的影响作用具有明显的剂量依赖性。本研究结果显示，EGCG可有效抑制RPE细胞周期的正常转换，使细胞在S期堆积，从而阻止细胞有丝分裂，使细胞增生受到抑制，见表2。



2.3　EGCG对人RPE细胞P21和P27 mRNA表达的影响　检测结果表明：与阴性对照组相比，80 mg·L-1、160 mg·L-1EGCG药物处理组细胞内的P21和P27 mRNA表达均有不同程度的升高（均为P<0.05）；40 mg·L-1 EGCG药物处理组与阴性对照组相比，P27 mRNA表达也增高（P=0.015），而P21 mRNA表达增高不明显（P=0.824）。P21和P27 mRNA表达量与EGCG浓度呈明显量效依赖关系（均为P<0.05），说明EGCG对细胞周期的抑制作用与其上调细胞周期素依赖性激酶抑制因子P21和P27 mRNA的表达有关。见表3。
2.4　EGCG 对 人RPE细胞 PDGFR-α、NF-κB和IκB蛋白表达的影响　Western blot结果表明40 mg·L-1、80 mg·L-1、160 mg·L-1 EGCG作用人RPE细胞后，NF-κB蛋白表达随着EGCG浓度的增加而减少，各药物处理组与阴性对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05）。80 mg·L-1、160 mg·L-1 EGCG亦能够抑制人RPE细胞IκB蛋白和PDGFR-α蛋白表达，与相应阴性对照组相比差异均有统计学意义（均为P<0.05），见表4和图1。EGCG对人RPE细胞内PDGFR-α、NF-κB和IκB的蛋白表达抑制作用呈明显的浓度依赖性（均为P<0.05）。





4　讨论
    PVR是由RPE细胞、基质细胞和炎性细胞等多种成分的增殖移行所致［3］，是我国人群中致盲率较高、难以治愈的眼病［4］。RPE细胞位于视网膜结构最外层，正常情况下RPE细胞处于静止状态；当发生孔源性视网膜脱离时RPE细胞从基底膜上播散下来，发生增殖分化。研究证实RPE细胞增生并形成膜是导致视网膜脱离的主要原因［5-6］。因此如何抑制人RPE细胞增生成为近年来防治PVR发生发展的主要途径和研究热点。本实验结果表明，EGCG在体外可有效抑制人RPE细胞增殖，具有一定时间和浓度依赖性。为了进一步探讨EGCG对人RPE细胞的增殖抑制作用，我们利用流式细胞术检测分析EGCG对RPE细胞周期的影响，EGCG作用24 h、48 h和72 h均会将RPE细胞阻滞于细胞周期的S期，这与EGCG上调细胞周期素依赖性激酶抑制因子P21和P27 mRNA的表达有关。
    视网膜疾病的发病机制通常由RPE细胞层的局部炎症引发，炎症主要与白细胞迁移和促炎细胞因子的分泌有关［7］，炎症反应启动后多种生长因子如PDGF、肿瘤坏死因子-α、成纤维细胞生长因子和细胞外基质表达增加，其中在损伤愈合反应中起重要作用的PDGF越来越受到人们的重视［8］。PDGF是一种二聚体糖蛋白，有α、β两种类型受体［9］。PDGFR-α可以结合A、B两种肽链，而PDGFR-β受体仅能结合B肽链［10］。RPE细胞是国内外公认的在PVR发生发展中起重要作用的细胞成分，在PVR患者的玻璃体内可以检测出PDGF呈高水平表达［11］。RPE细胞中的PDGFR-α受体在正常情况下表现为下调，但是有研究表明PVR的发生与PDGFR-α上调密切相关，且RPE细胞是PVR患者视网膜上最丰富的细胞类型，它的增生是导致PVR进展的主要机制之一，其表达的PDGFR-α上调也是PVR潜在发生的原因之一。因此，抑制RPE细胞中的PDGFR-α活化信号有可能防止PVR发展。
    近年来，茶多酚的研究越来越受到人们的重视。EGCG是茶多酚的主要活性成分，具有显著的抗氧化、抗炎等特点［2］，在诸多疾病，如心血管疾病、肿瘤、炎症性肠病等中有广泛应用［12］。本研究发现，80 mg·L-1、160 mg·L-1 EGCG 刺激人RPE细胞48 h明显下调了PDGFR-α蛋白和IκB蛋白的表达，但是其下游的信号机制并不明确。已发现EGCG可以影响多条不同的信号转导通路，如抑制许多蛋白激酶的活性、抑制转录因子（如NF-κB）激活的信号转导通路等［13-14］。NF-κB与炎症反应相关，能够促进细胞增生，本研究发现，40 mg·L-1、80 mg·L-1、 160 mg·L-1 EGCG刺激人RPE细胞48 h后明显下调了NF-κB蛋白的表达，提示EGCG所引起的增殖抑制及细胞周期阻滞作用可能与其抑制了人RPE细胞早期炎症反应有关。